[发明专利]一种甾体5β还原酶变体及其用途

权利要求书

1.一种具有甾体5β还原酶活性的甾体5β还原酶变体，所述甾体5β还原酶变体的氨基酸序列包括两个相邻位点的RR突变为相邻的KH。

2.根据权利要求1所述的甾体5β还原酶变体，其中所述甾体5β还原酶变体包含R63K和R64H突变，能够利用NADH为辅酶，且具有选自以下的氨基酸序列：

1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；或

3)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5具有69％以上序列同一性的氨基酸序列；

优选地，所述甾体5β还原酶变体能够利用NADPH和NADH为辅酶。

3.根据权利要求1或2所述的甾体5β还原酶变体，其中所述甾体5β还原酶变体催化底物所获得的产物5位的氢构象为β型。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的甾体5β还原酶变体，其中所述甾体5β还原酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示。

5.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的甾体5β还原酶变体；优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。

6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸；优选地，所述表达载体为真核或原核生物的染色体；优选地，所述表达载体选自真核表达载体或原核表达载体；优选地，所述表达载体为质粒，优选为pcDNA3.1或pET26b(+)。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的表达载体；

优选地，所述宿主细胞选自真核细胞或原核细胞；

更优选地，所述真核细胞是真菌细胞，更进一步优选为酵母菌；

更优选地，所述原核细胞选自大肠杆菌、分枝杆菌、假单胞菌、红球菌、节杆菌、枯草杆菌或放线菌细胞；更进一步优选为大肠杆菌T7 express或BL21(DE3)细胞。

8.一种甾体5β还原酶组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的甾体5β还原酶变体。

9.一种制备权利要求1-4中任一项所述的甾体5β还原酶变体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在有助于生产所述甾体5β还原酶变体的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，以及

(2)从得到的培养液中获得所述甾体5β还原酶变体。

10.权利要求1-4中任一项所述的甾体5β还原酶变体、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的宿主细胞或权利要求8所述的组合物在制备5β-氢的甾体中的用途；

优选地，所述5β-氢的甾体为5β-孕甾烷-3,20-二酮、20-羟甲基-5β-孕甾-3-酮或胆酸类化合物；

更优选地，所述胆酸类化合物为具有去氧胆酸骨架结构的化合物，例如脱氧胆酸。

11.一种用于制备5β-氢的甾体的方法，其包括使用权利要求1-4中任一项所述的甾体5β还原酶变体、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的宿主细胞或权利要求8所述的组合物制备5β-氢的甾体；优选地，所述5β-氢的甾体为5β-孕甾烷-3,20-二酮、20-羟甲基-5β-孕甾-3-酮或胆酸类化合物；更优选地，所述胆酸类化合物为具有去氧胆酸骨架结构的化合物，例如脱氧胆酸。