[发明专利]A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用

权利要求书

1.A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，其特征在于，在载体的多克隆位点处插入含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列；

所述含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，其特征在于，所述载体为M-pSK载体。

3.根据权利要求1或2所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，其特征在于，所述多克隆位点为KpnI/NotI。

4.权利要求1~3任意一项所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研的RNA为模板，分别用引物对S1F/S1R、S2F/SmR、SmF/S2R和S3F/S3R进行RT-PCR扩增，获得扩增产物分别为S1、Sm1、Sm2和S3片段；

所述S1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述S1R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述S2F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述SmR的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述SmF的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述S2R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述S3F的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述S3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

2）利用融合PCR将得到的Sm1和Sm2片段进行融合，获得S2片段；

3）将所述S1、S2和S3片段克隆到载体中，获得包含SVA基因组全长cDNA的克隆。

5.根据权利要求4所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增的反应程序：50℃，30min；94℃，2min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸130s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

6.根据权利要求4所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，所述融合PCR是以所述Sm1和Sm2片段为模板，以所述S2F和S2R为引物对进行融合PCR扩增；

所述融合PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；然后98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸200s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，S1片段克隆到载体的多克隆位点为Kpn I/NdeI；

S2片段克隆到载体的多克隆位点为Nde I/Bgl II；

S3片段克隆到载体的多克隆位点为Bgl II/Not I。

8.权利要求1~3任意一项所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆在拯救A型塞内卡病毒中的应用。

9.基于权利要求1~3任意一项所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆拯救得到的病毒rSVA-HN，其特征在于，通过沉默突变在2B基因处引入了一个XhoI酶切位点，同时消除了一个Xma I 酶切位点；

所述病毒rSVA-HN和亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研株的形态结构、大小、感染性、生长速度及病毒效价一致。

10.权利要求9所述病毒rSVA-HN在制备A型塞内卡病毒标记疫苗中的应用。