[发明专利]一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法及其应用在审
申请号: | 202011218400.1 | 申请日: | 2020-11-04 |
公开(公告)号: | CN112322714A | 公开(公告)日: | 2021-02-05 |
发明(设计)人: | 韩铖潇;徐珂;周浩;何川;丁金梅;秦超;罗怀希;孟和 | 申请(专利权)人: | 上海交通大学 |
主分类号: | C12Q1/6869 | 分类号: | C12Q1/6869;G16B30/10 |
代理公司: | 上海科盛知识产权代理有限公司 31225 | 代理人: | 褚明伟 |
地址: | 200240 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 基因 编辑 效率 模式 方法 及其 应用 | ||
1.一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,提取样本基因组DNA,对待测区设计引物并扩增;
S2,构建文库进行高通量测序,并对数据进行过滤、拆分和拼接,得到待测区序列;
S3,将待测区序列与基因组参考序列比对,得到每个样本的基因编辑效率和基因编辑模式;
S4,对处理组样本和对照组样本的基因编辑效率作显著性分析并输出校正后结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法,其特征在于,所述步骤S1中对待测区设计引物的过程中,设计的引物是添加了不同接头序列的扩增引物,能够在多样本混合测序时区分每个样本。
3.根据权利要求1所述的一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法,其特征在于,所述S1中对待测区设计引物的过程中,设计的引物左右两端测序重叠区大于10bp,能够拼接双端序列。
4.根据权利要求1所述的一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法,其特征在于,所述步骤S2中构建文库进行高通量测序,并对数据进行过滤、拆分和拼接包括以下步骤:
S21,使用Illumina高通量测序平台对扩增子文库进行高通量测序;
S22,对测序所得双端序列进行质量过滤,去除长度小于36bp的reads,修剪质量值小于30的reads;
S23,将质量过滤所得双端序列按不同接头序列的扩增引物序列拆分序列,并对前端序列和后端序列进行拼接。
5.根据权利要求4所述的一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法,其特征在于,使用Illumina高通量测序平台对扩增子文库进行高通量测序的测序深度为30000~60000×。
6.根据权利要求4所述的一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法,其特征在于,所述步骤S2中拼接条件为最小重叠区10bp,重叠区错配碱基比例小于10%。
7.根据权利要求1所述的一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法,其特征在于,所述步骤S3中将待测区序列与基因组参考序列比对的方法包括:
使用基于CRISPRpic修改的脚本将待测区序列与基因组参考序列进行比对,得到每个样本的序列比对结果;并将序列比对结果进行统计,得到每个样本的基因编辑效率、基因编辑效率组成模式图、碱基删除位点模式图、碱基删除长度模式图、碱基插入长度模式图、碱基移码突变模式图。
8.根据权利要求1所述的一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法,其特征在于,所述步骤S4中显著性分析包括:
对处理组样本和对照组样本的基因编辑效率作单因素方差分析,如果p-value0.05,那么认为其基因编辑效率具有统计学意义,将处理组样本数据滤去对照组样本的背景噪音后输出校正后结果,否则不输出校正后结果并提示。
9.权利要求1所述的一种检测基因编辑效率和基因编辑模式的方法在筛选基因编辑突变体中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述基因编辑突变体包括动物基因编辑突变体、植物基因编辑突变体、真菌基因编辑突变体和原核生物基因编辑突变体。
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