[发明专利]微生物发酵生产HIP-IPA的方法、基因工程菌及应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及微生物发酵生产HIP‑IPA的方法、工程菌及应用。本发明的HIP‑IPA工程菌是将HIP‑IPA生产菌的出发菌株中的编码酰基辅酶A硫解酶的基因敲除，同时过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶和DNA结合蛋白的基因构建获得，实现从植物甾醇出发，通过生物转化实现HIP‑IPA的生产，具有十分显著的效果。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及微生物发酵生产HIP-IPA的方法、工程菌及应用。

背景技术

甾体是一类具有环戊烷多氢菲环结构的化合物，通常在C-10和C-13位有甲基基团，在C-17位有烷基侧链。甾体作为一种细胞膜的组分，在生物体中具有重要的作用。一些甾体还具有激素和信号分子的作用。自上世纪50年代发现甾体药物以来，到目前为止已经鉴定了300多种甾体药物。甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等，甾体激素药物已成为仅次于抗生素的第二大类药物。

根据《甾体化学进展》（周维善、庄治平主编，科学出版社2002年出版，ISBN 7-03-009607-X）报道，很多微生物包括诺卡氏菌（Nocardia）、分枝杆菌（Mycobacterium）、节杆菌（Arthrobocter）、和假单胞杆菌（Pseudomonas）等都可将甾体母核环戊烷多氢菲及侧链全部氧化成二氧化碳和水。代谢途径经Sih及其合作工作者（参考文献“Sih CJ, Wang KC,Tai HH. Mechanisms of steroid oxidation by microorganisms. XIII. C22 acidintermediates in the degradation of the cholesterol side chain. Biochemistry,1968, 7: 796-807”）的研究阐述如图1所示。该过程表明，在微生物降解过程中可通过控制不同酶的活力，获得如4-AD（化合物15）、9-OH-AD，HIP（化合物21）和谷内酯（化合物24）等重要的中间体。王风清等的研究表明（申请号：CN201910510202.3），在分枝杆菌中敲除编码酰基辅酶A硫解酶（Hsd4A）的基因，可用于生产22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮、22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮和9ɑ,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-二烯-3-酮。美国专利US 20110191875A1报道了通过在分枝杆菌中阻断DNA结合蛋白（CxgB）的活力，抑制了植物甾醇转化生产4-雄烯二酮（4-AD）过程中副产物22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮和22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的产生，推测乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶（CxgA）也参与到了植物甾醇转化生产22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮和22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的代谢途径中。

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