[发明专利]一种全转录组水平RNA结构检测方法及其应用

说明书

本发明涉及一种RNA结构检测方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过在RNA结构检测方法包括去除背景逆转录终止信号的步骤，降低了结构分数计算中的假阳性信号，从而提高检测方法的准确性，使得能够以非常低的样品量进行体内细胞的RNA结构分析，并进一步评估细胞的功能状态。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全转录组水平RNA结构检测方法及其应用。

背景技术

RNA具有不同的功能，如：作为信使传递遗传信息，作为核酶催化反应等等。RNA分子在其整个生命周期中并且在不同的亚细胞位置均受到精确调节。复杂且灵活的结构是RNA分子的功能多样性和精细调节的核心。RNA结构的错误折叠能够干扰可变剪接、翻译、RNA修饰和编辑以及RNA-蛋白质相互作用等过程，从而引起疾病。

RNA结构检测方法利用了特异性修饰单链核苷酸的化学试剂。修饰位点能够干扰逆转录(RT)的进行，导致RT停止或突变，因此能够通过测序和生物信息学分析方法检测到修饰位点信息，从而获得RNA结构信息。大多数试剂只能检测一个或两个碱基的结构信息；例如，硫酸二甲酯(DMS)修饰单链胞嘧啶和腺嘌呤，乙二醛修饰单链鸟嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤，并且乙氧二羟丁酮修饰单链鸟嘌呤。引物延伸的选择性2-羟基酰化分析法(SHAPE)试剂能够修饰单链区段内核糖的2'OH基团，并能获得所有四种核苷酸的结构信息。

全局RNA结构检测研究已经揭示了功能性RNA位点处往往存在结构差异，例如蛋白质和miRNA结合位点，并且已有研究表明RNA结构能够参与调节RNA的剪接、翻译和降解过程。值得注意的是，几项研究已经表明了RNA序列可以在体内与体外、在不同的亚细胞区间以及在胚胎发生的不同阶段形成不同的结构。实际上，细胞中的许多因素可以影响RNA结构，包括pH、阳离子浓度、内源RNA修饰(例如，甲基化、乙酰化)以及与蛋白质和/或其他RNA的相互作用。因此，在其最相关的自然环境中研究RNA结构对于揭示RNA功能和调节机制至关重要。

然而，目前最先进的RNA结构检测方法通常需要大量RNA作为起始量，这会限制其实际应用。例如，icSHAPE和Structure-seq2的RNA文库的构建需要大约10⁷个细胞，这对于罕见的原代细胞和许多组织样品的生物学研究是难以实现的。因此，除了实验上易收集的斑马鱼早期胚胎和果蝇卵巢的一些研究之外，迄今为止的RNA结构检测研究仅限于培养的细胞系。然而，细胞系中的细胞环境和由此生成的RNA结构可能显著偏离原代样品，从而使得其结果不能真实反应细胞的功能状态。

发明内容

为了解决这一障碍，我们开发了smartSHAPE(small amount random RT icSHAPE，小量随机RT icSHAPE)，一种基于icSHAPE方法改进的新型低起始量RNA二级结构检测方法。

因此，

本发明第一方面，提供一种RNA结构检测方法，其中，所述方法包括：

1、获得包含RNA的样本；2、smartSHAPE库准备；3、RNA结构检测和分析，其中，所述步骤2smartSHAPE库准备包括：(1)、RNA修饰和制备；(2)RNA逆转录，去除非修饰位点引起的逆转录终止信号(premature RT stops)，和cDNA富集。

优选的，所述RNA结构检测方法的步骤2还包括(3)、接头连接，第二链合成，和扩增。更优选的，所述接头连接包括3’接头连接和5’接头连接。

优选的，所述背景逆转录终止信号由非RNA修饰位点导致。更优选的，所述背景逆转录终止信号可能源于内源修饰(例如m¹A修饰)、局部结构(例如G-四链体)，或者源于逆转录酶的随机脱落。

更优选的，采用核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)消化去除背景逆转录终止信号，更优选的，采用RNase I消化去除背景逆转录终止信号。