[发明专利]一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种鸡毒支原体单克隆抗体，其特征在于：

(1)成功筛选到一株能稳定分泌鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A1；

(2)得到一重链在50KDa，轻链在26KDa纯度理想的单抗；

(3)通过间接ELISA方法，一抗加入采集的腹水，二抗是鼠抗IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM酶标二抗，检测到该单抗亚类为IgG3；

(4)利用Western blot检测到鸡毒支原体单克隆抗体具有特异性。

2.一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)抗原的准备：将课题组前期分离得到的一株鸡毒支原体本地分离株即MG-HS的pMGA1.2基因进行克隆、表达，提取、纯化重组蛋白；

(2)免疫动物：选取6周龄的BALB/C小鼠6只，在每只小鼠颈背部皮下多点注射0.5mL/只(约含500mg蛋白)的免疫原，进行三次加强免疫，选取1、3号血清效价均达到1∶1.28×10⁴的小鼠进行后续融合实验；

(3)制备骨髓瘤细胞和免疫脾细胞为饲养细胞；

(4)细胞融合：采用50％的PEG1450作融合剂进行细胞融合，细胞融合按常规方法进行，将融合细胞接种到96孔板中，第十天左右，集落长到占孔底1/4大小，即可进行抗体检测；

(5)建立了间接ELISA方法；

(6)杂交瘤细胞的选择性培养与克隆：采用常规有限稀释法对阳性孔进行克隆，细胞融合后第7天，在倒置显微镜下对培养板进行观察，在有集落出现孔的培养板盖上方用记号笔打对勾，标明集落的位置，用新鲜HAT培养基半量换液一次，以逐步替代HAT培养基，一般HAT选择性培养3-5天即可出现小克隆，杂交瘤细胞体积较大，圆而透亮，其他细胞透光性差并逐渐死亡；培养12-15天，克隆可长至占孔底面积的1/3-1/2，进行4次克隆，获得一株能稳定分泌抗pMGA1.2单克隆抗体的杂交瘤细胞，此时可取培养上清进行抗体检测(称融合后抗体检测)；间接ELISA方法检测细胞培养液上清效价；

(7)进行杂交瘤细胞的保存和复苏；

(8)利用小鼠腹水法产生单克隆抗体，本发明通过用灭菌的石蜡(0.5mL/只)腹腔注射小鼠，10天后，将扩大培养后的2A1杂交瘤细胞腹腔注射小鼠(0.5mL/只)，8-12天后当出现腹部肿大且行走困难的小鼠时，进行采集腹水并检测腹水效价。间接ELISA方法测得2A1杂交瘤细胞的腹水效价为1∶1.024×10⁵；

(9)鉴定单克隆抗体的亚型，采用Thermo Scientific Pierce公司ELISA小鼠单克隆抗体分型试剂盒检测；

(10)采用Western blot检测单克隆抗体的特异性，得出该单克隆抗体为pMGA1.2的特异性抗体。