[发明专利]基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组，其中，所述通用引物能够结合至曲霉属真菌的基因保守区，从而能够在实时荧光PCR中扩增源自曲霉属真菌的保守片段，所述特异性探针组包括能够与所述保守片段的部分序列互补结合的第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针能够与源自烟曲霉的序列特异性互补结合，所述第二探针能够与源自土曲霉的序列特异性互补结合，所述第三探针能够与源自曲霉属真菌的保守序列特异性互补结合。

2.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，第一探针包含对应于第一通道的荧光染料，第二探针包含对应于第二通道的荧光染料和第三探针包含对应于第三通道的荧光染料。

3.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH₄)₂SO₄、5-10mM MgSO₄，且pH值为8.0-8.5。

4.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，进一步包含内部质控和阳性质控。

5.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，所述通用引物的序列如SEQ ID NO：1和2所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO：4所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO：5所示。

6.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，进一步包含针对烟曲霉耐药位点的引物和探针，且针对烟曲霉耐药位点的正向引物与反向引物的摩尔比为1:(8-10)，针对烟曲霉耐药位点的探针设计为与野生型探针的Tm差值为2。

7.根据权利要求6所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，所述烟曲霉耐药位点选自TR34、L98H、Y121F和T289A组成的组中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，进一步包括热启聚合酶。

9.根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括使用所述通用引物和所述特异性探针组构建反应体系的步骤，和对所述反应体系进行PCR扩增的步骤。

10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述PCR扩增包括：

(1)预变性步骤，条件为2分钟、95℃；

(2)循环反应步骤，条件为15秒、94℃变性，60秒、58℃退火、延伸，共30-50个循环；

(3)熔解步骤：45℃、90秒，然后由45℃梯度升温至85℃。