[发明专利]真核表达的A型流感病毒PB2cap蛋白的应用

权利要求书

1.真核表达的A型流感病毒PB2cap蛋白在检测A型流感病毒RNA帽结合活性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真核表达的A型流感病毒PB2cap蛋白通过下述方法得到：在cap-binding结构域的3’端添加组氨酸标签构建真核表达质粒，并通过将重组质粒转染293T细胞48h后，收取细胞裂解物，利用镍亲和层析柱分离纯化得到PB2cap与组氨酸标签的融合蛋白。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，构建真核表达质粒过程中，真核表达载体为pCAGGS，酶切位点为EcoRⅠ、XhoⅠ。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用真核表达的PB2cap蛋白在体外与m⁷GTP进行帽结合实验，步骤如下：

1)吸取100μL m⁷GTP琼脂磁珠转移至新1.5mL指形管；

2)500rpm离心30s沉淀琼脂磁珠，小心地弃去上清液；

3)加入500μLTBS，pH8.0重悬琼脂磁珠，重复步骤2)洗去琼脂磁珠保存液进行平衡，共重复平衡2次；

4)在平衡好的m⁷GTP琼脂磁珠中加入50μg真核表达PB2cap蛋白，4℃摇床缓慢晃动结合3h；

5)500rpm离心30s沉淀琼脂磁珠，小心地弃去上清液；

6)加入500μL洗涤液重悬琼脂磁珠，重复步骤5)洗去未结合蛋白，共重复洗涤5次；

7)为去除非特异性结合，加入600μL含1mM m⁷GTP的洗涤液，4℃摇床缓慢晃动结合1h；

8)500rpm离心30s沉淀琼脂磁珠，小心地弃去上清液；

9)在琼脂磁珠中加入50μL2x loadingbuffer，煮沸后进行SDS-PAGE考马斯亮蓝染色或Western-Blot分析。