[发明专利]一种人源黑素瘤细胞A375/DR5稳转株裸鼠移植瘤模型的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及动物模型的构建领域，具体是一种人源黑素瘤细胞A375/DR5稳转株裸鼠移植瘤模型的构建方法及其应用。本发明通过构建人源黑素瘤细胞A375/DR5稳转株裸鼠移植瘤模型，改善原有动物模型中DR5表达差异性大，重现性低，靶向评价困难等问题，为以DR5为靶标的靶向药物评价提供理想的实验动物平台，提高恶性黑素瘤靶向药物临床前研究的可靠性及有效性，具有一定的实际应用价值。也可为其他肿瘤的实验动物研究和抗肿瘤靶向药物的评价提供研究思路和实验依据，具有重要的科学意义。

技术领域

本发明涉及动物模型的构建领域，具体地说，是一种人源黑素瘤细胞A375/DR5稳转株裸鼠移植瘤模型的构建方法及其应用。

背景技术

恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)，简称恶黑，是一种恶性程度很高的肿瘤，是皮肤肿瘤中侵袭性和致死性最强的一种，具有预后差，易转移，易复发，易耐药等特点，治疗难度大、死亡率极高。迄今为止，还没有一种有效的治疗手段能延长MM患者的存活期。抗肿瘤主动靶向药物被认为是目前最有希望治愈像MM这种恶性肿瘤的高效低毒的药物之一。但是，目前在抗MM的主动靶向药物研究开发过程中，还存在着许多问题和挑战，其中关键问题之一是缺乏理想的可用于评价主动靶向药物疗效的恶性黑素瘤动物模型。因此，构建稳定可靠的MM动物模型，是研究开发抗黑素瘤靶向药物过程中急需解决的问题，也是近年来的研究热点。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL的受体之一DR5在黑素瘤细胞及多数肿瘤细胞表面均高表达，TRAIL及DR5的激动型抗体与DR5结合能有效地特异性杀伤肿瘤细胞和促使肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有细胞毒性作用。因此，DR5可以被认为是极具潜力的抗黑素瘤靶点，而构建DR5稳定及高表达的人源黑素瘤细胞株移植瘤动物模型，无疑是开发以DR5为靶标的主动靶向药物研究过程中很重要的环节。国内外虽已建立起多种黑素瘤模型，但人源性的黑素瘤移植瘤模型的建立则少有报道，尤其缺乏特异性高表达相关靶标的黑素瘤动物模型的研究，关于用于评价特定靶向药物的黑素瘤瘤模型研究也鲜有报道。因此，有必要开发建立理想的用于评价抗黑素瘤靶向药物的靶向性及增效减毒特点的肿瘤动物模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定转染DR5靶标的人源黑素瘤A375细胞株的裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，为广大研究者提供一种靶标表达稳定，个体差异小，可控性和可靠性强，重复性和实用性好的肿瘤动物模型。

本发明的第一方面，提供一种人源黑素瘤细胞A375/DR5稳转株裸鼠移植瘤模型的构建方法，是选用人源黑素瘤高转移细胞株A375为成瘤细胞，先将DR5基因稳定转入人源黑素瘤细胞A375，经筛选后获得造模用的DR5稳定高表达的A375/DR5细胞株，再将其通过背部皮下注射建立所述的人源黑素瘤细胞A375/DR5稳转株裸鼠移植瘤模型。

进一步的，所述的DR5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

更进一步的，所述的DR5稳定高表达的A375/DR5细胞株的制备方法，包括以下步骤：

A、携目的基因的质粒的构建

pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-Puro载体图谱构建：根据DR5的序列，设计目的片段，插入MCS区，由CMVIE启动子调控表达，该载体中含有EF1启动子调控的ZsGreen基因和Puro共表达；

B、慢病毒包装

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养48h和72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，0.45um滤器过滤病毒上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。500ul新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80度甚至液氮保存。滴度测定。

C、TNFRSF10B慢病毒A375细胞建系