[发明专利]用于细菌表达DacA时提高c-di-AMP产量的多核苷酸

说明书

本发明公开了一种用于细菌表达DacA时提高c‑di‑AMP产量的多核苷酸，其组成为：Ptet‑可变翻译起始区‑dacA，其中Ptet是启动子；可变翻译起始区是ATG前17个碱基至ATG之后6个碱基的序列；dacA是编码二腺苷酸环化酶DacA的基因。克隆了该多核苷酸的重组菌株能够高产c‑di‑AMP。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种用于细菌表达二腺苷酸环化酶A(DacA)时提高c-di-AMP产量的多核苷酸。

背景技术

2008年，Witte等在解析枯草芽胞杆菌DNA完整性扫描蛋白A(DNA integrityscanning protein A，DisA)晶体结构时发现了环二腺苷酸(Cyclic diadenosinemonophosphate，c-di-AMP，简写CDA)分子，因此将DisA命名为二腺苷酸环化酶(Diadenylate cyclase，DAC)，并将其具有催化活性的结构域命名为Dac结构域。c-di-AMP是由两分子ATP经二腺苷酸环化酶A(Diadenylate cyclase A，DacA)催化合成的环状核苷酸分子。

环二腺苷酸(c-di-AMP，简写CDA)是细菌中广泛存在的第二信号分子。c-di-AMP在细菌中的代谢受二腺苷酸环化酶A(DacA)和磷酸二酯酶(PDE)的精密调控。c-di-AMP不仅调节细菌生长、细胞壁稳态、离子转运多种生理过程，而且能够被真核宿主胞内多种感应子/受体蛋白识别，从而调控抗感染免疫。细菌c-di-AMP参与调控宿主I型干扰素应答、NF-κB信号通路活性、自噬以及炎症小体应答等固有免疫应答。此外，c-di-AMP作为黏膜佐剂可诱导宿主适应性免疫。c-di-AMP被认为是一种新发现的病原体相关的分子模式(PAMP)，已成为细菌疫苗和药物研究中的新靶点。

由于细菌的c-di-AMP参与细胞凋亡等生理活动，因此利用工程细菌产c-di-AMP时需要精确调至合适的剂量。

大肠杆菌属Nissle 1917(EcN)是一种非致病性大肠杆菌，是1917年从一次志贺菌痢大爆发时未出现腹泻的士兵的粪便中分离得到的。EcN是非乳酸益生菌中研究最多的益生菌，血清型为O6：K5：H1，具有独特的基因组、半粗糙O6-脂多糖(LPS)表型、K5型荚膜、3种不同的菌毛(F1A、F1C和卷曲菌毛)。EcN具有小菌素和铁摄取系统等特殊适应性因子，在与其他微生物竞争中起关键作用。EcN能长期稳定定植于肠道，与肠上皮细胞相互作用，被广泛用于预防传染性腹泻、炎性肠疾病如溃疡性结肠炎和克罗恩病，防止新生儿消化道内病原菌定殖等，和发挥免疫调节生物学功能。

发明内容

我们已经对大肠杆菌属Nissle 1917(EcN)进行了长期的研究，并构建了一系列具有应用前景的菌株，包括TYS001菌株，参见文献(Immunotherapy with engineeredbacteria by targeting the STING pathway for anti-tumor immunity.DanielS.Leventhal，Anna Sokolovska，Ning Li，Christopher Plescia，Jose M.Lora.NATURECOMMUNICATIONS.2020,11:2739.DOI：10.1038/s41467-020-16602-0.。

在利用大肠杆菌Nissle 1917(EcN)表达DacA时，c-di-AMP是表达dacA基因后的代谢产物。为了提高c-di-AMP的产量，我们对于dacA基因表达盒的结构进行了大量的探索和优化。因此，本发明的目的在于提供一种用于细菌表达DacA时提高c-di-AMP产量的多核苷酸，其组成为：Ptet-可变翻译起始区-dacA，其中

Ptet是启动子；可变翻译起始区是ATG前17个碱基至ATG之后6个碱基的序列；dacA是编码二腺苷酸环化酶A(Diadenylate cyclase A，DacA)的基因。