[发明专利]一种靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列及其筛选方法

权利要求书

1.一种靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列的筛选方法，其特征在于：包括，

设计CRISPR序列，所述CRISPR序列如序列SEQ NO.1～SEQ NO.8所示；

用所述CRISPR序列制备含目标基因片段的PCR扩增产物，所述目标基因片段如序列SEQNO.9所示；

将所述含目标基因片段的PCR扩增产物与载体连接、转化后筛选阳性转化子，经克隆摇菌并抽提出包含目的基因的质粒；

根据设计的CRISPR序列，用体外转录方法制备sgRNA；

将所述sgRNA、所述包含目的基因的质粒和Cas9蛋白显微注射斑马鱼受精卵，以斑马鱼受精卵作为反应器筛选编辑斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列。

2.如权利要求1所述的靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列的筛选方法，其特征在于：所述CRISPR序列位于zbtb38基因外显子393bp之前。

3.如权利要求1或2项所述的靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列的筛选方法，其特征在于：所述sgRNA，其序列包括序列SEQ NO.21～SEQ NO.28中所示的一种或几种。

4.如权利要求1所述的靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列的筛选方法，其特征在于：所述用体外转录方法制备sgRNA，其使用的正向引物序列包括序列SEQ NO.12～SEQNO.19所示中的一种或几种。

5.如权利要求1-2、4任一项所述的靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列的筛选方法，其特征在于：所述经克隆摇菌并抽提出包含目的基因的质粒，其使用的引物序列包括如序列SEQ NO.10、SEQ NO.11中所示的一种或几种。

6.如权利要求5所述的靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列的筛选方法，其特征在于：所述经克隆摇菌并抽提出包含目的基因的质粒，其使用的载体为pGEM-T Easy载体。

7.如权利要求1所述的靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列的筛选方法，其特征在于：所述显微注射，其使用的所述sgRNA在注射液中的终浓度为100ng/μL，Cas9蛋白的终浓度为250ng/μL。

8.用于靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的序列，其特征在于：包括，

CRISPR序列，如序列SEQ NO.7所示；

引物，包括序列SEQ NO.10～SEQ NO.20中所示的一种或几种；以及，

sgRNA序列，包括序列SEQ NO.21～SEQ NO.28中所示的一种或几种。