[发明专利]一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统的构建及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统及其的构建方法和应用。系统载体含Cas9失活蛋白、转录激活效应蛋白VP64、抗性选择标记基因、至少一个gRNA支架序列和增强转录激活的特异序列(SunTag序列)。所述的用于微拟球藻基因转录激活CRISPRa载体在基因转化中的应用。本发明为微拟球藻基因功能研究提供了一种新的模型和可行性方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统及其的构建方法和应用。

背景技术

海洋拟球藻微拟球藻是一种单细胞光合微藻，广泛分布于海洋、湖泊、沼泽等不同水环境水域。由于它的油脂含量高、较好的环境适应性及适于烟道气培养等特性，在微藻生物能源、微藻功能食品、微藻饲料等领域备受青睐，是“蓝色粮仓”的重要生物资源之一。随着近些年合成生物学的兴起，微拟球藻已经崛起为新一代的合成生物学光合底盘细胞之一，发展到与模式藻株如莱茵衣藻、小球藻等同等重要的位置。截至目前，已有多株微拟球藻的全基因组被测序，基本涵盖了本属内的已知代表物种，包括N.oceanica IMET1，N.oceanica CCMP1779，N.oceanica CCMP526，N.oceanica CCMP526等。尽管对其开展了全基因组测序，但是它们基因绝大多数(占50％以上)都是未知功能的，对于代谢过程的理解仍然是一个“黑箱”。这就需要我们发展遗传转化方法和基因操作工具去揭开这个“黑箱”之谜。值得庆幸的是，基于电转化或基因枪等遗传转化方法在几株微拟球藻(N.oceanicaIMET1，N.oceanica CCMP1779，N.oceanica CCMP526，N.oceanica CCMP526等)代表种也基本已经建立，正反向遗传学工具如随机插入突变、过表达、RNAi技术和同源重组的方法在不同种(如N.salina)里面也有报道。另外，基因编辑技术在几株代表物种(如N.salina)也已经建立，如基于episome的无选择压力基因编辑等。

基因编辑CRISPR-Cas9是目前应用最广泛的CRISPR系统，除了被用于在细胞系、干细胞和诱导多功能干细胞水平上快速高效的编辑原核细胞和真核细胞的基因外，还在很多其他领域被广泛使用。比如，利用失活的CRISPR-Cas9蛋白(简称dCas9蛋白)与特定的功能的结构域蛋白(如转录激活结构域VP64，转录抑制结构域KRAB，表观遗传调控乙酰化结构域P300和甲基化结构域DnMT3a等)融合表达，再结合使用特异性引导RNA，可以达到特异性调控某一基因表达水平的目的。这一技术体系已经成功用于哺乳动物和植物研究体系。目前，高覆盖量的sgRNA库已经诞生，可以覆盖到细胞的每一个基因，再通过正负筛选的方法，筛选到感兴趣的通路或基因，这一技术大大拓展了科学家研究功能基因组学的方法。但这一技术在植物，尤其是在微藻中，由于基因编辑方法建立的较慢，并且对转录激活复合体系的认识和其它常用转录激活结构域能不能在微藻中应用还是不清楚，进而转录激活系统在微藻中建立还是十分少见。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统及其的构建方法和可用于微拟球藻的代谢工程改造和合成生物学研究，优化藻种特异经济性状的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统，系统载体含Cas9失活蛋白、转录激活效应蛋白VP64、抗性选择标记基因、至少一个gRNA支架序列和增强转录激活的特异序列(SunTag序列)。

所述系统以微拟球藻用Cas9表达载体(pNOC-ARS-CRISPR)作为骨架，其含有内源启动子和终止子，其中，启动子为Ribi双向启动子和LDSP启动子，终止子为LDSP终止子。

所述骨架载体Ribi双向启动子一端依次连接dCas9蛋白、增强转录激活的特异序列和转录激活效应蛋白；另一端连接gRNA支架序列，其驱动gRNA表达；潮霉素抗性基因位于骨架载体LDSP启动子下游；所述dCas9蛋白、增强转录激活的特异序列和转录激活效应蛋白之前均通过前导核定位信号连接。