[发明专利]一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法

权利要求书

1.一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，包括植物基本培养基:MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+10g/L胰蛋白脉+5g/L酵母提取物，pH＝5.8；

LB培养基:NaCl 10g、酵母粉5g、蛋白脉10g，定容至1000ml，pH＝7.0；

Hurek液体培养基:KHPO41.0g、KHPO41.5g、Fe 10ml、KCl 0.15g、CaCly·2H·O 0.4g、MgSO47H O0.4g、微量元素1ml、味精0.43g、苹果酸0.2g，定容至1000ml，pH＝6.4，其特征在于，所述具体包括如下步骤：

a.取样：选择无病害、无虫害的优良甘蔗组培苗；

b.清洗：以流动的清水对甘蔗组培苗进行漂洗；

c.脱毒：温水脱毒或空气高温脱毒，温水脱毒是将甘蔗组培苗置于48～50℃的温水中浸泡0.6～2h；空气高温脱毒是将甘蔗组培苗置于46℃的热空气中至少4周；

d.甘蔗组培苗的继代培养：将脱毒后的甘蔗组培苗分株后，用镊子将其移入植物基本培养基中培养，3周后进行第二次继代培养，观察其生长情况，组培苗培养条件为:25℃-30℃，光照16-17h；

e.甘蔗组培苗移栽：将经过二次继代培养后的组培苗移栽到纸盆中，外面用保鲜膜覆盖，保持足够湿度，隔天浇水，培养条件:25℃-30℃，光照16-17h；

f.甘蔗盆栽苗的移栽及开放培养：对保鲜膜覆盖的盆栽苗进行适当炼苗，将甘蔗苗移栽到花盆中，不再覆盖保鲜膜，隔天浇水，适时松土，培养条件:25℃-30℃，光照16-17h；

g.甘蔗苗接种固氮菌：将用LB培养基活化过的固氮菌按2％的接种量接种于Hurek液体培养基中,在落地式摇床中32℃，260r/min培养4天，每周进行一次实验；

h.对甘蔗盆栽苗进行测量：从开始接种固氮菌起，每周日对盆栽苗进行测量，测量内容包括植株地上部分高度、植株直立高度及植株茎高等，记录各组数据。

2.根据权利要求1所述的一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，其特征在于，所述a步骤中的取样操作应在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行清洗和脱毒。

3.根据权利要求1所述的一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，其特征在于，所述植物基本培养基加入双蒸水至1000mL，用5mol/L NaOH(0.2ml)，121℃灭菌30min后方可使用。

4.根据权利要求1所述的一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，其特征在于，所述LB培养基通过在950ml去离子水中加入NaCl 10g、酵母粉5g、蛋白脉10g，定容至1000ml的容器中，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min得到。