[发明专利]基于等温指数扩增的microRNA生物传感器

说明书

本专利建立了一种基于核酸扩增策略的简单、灵敏且能快速检测microRNA的生物传感器，其制备方法是通过靶microRNA借助催化发卡自组装与发卡探针HP1杂交后，再经过酶介导的等温指数扩增后产生大量DNA单链，DNA单链与荧光发卡探针杂交，从而产生可以检测的荧光信号，从而实现快速灵敏地对靶microRNA进行定量检测。该检测方法的线性范围是100fmol/L到10nmol/L，检测限为5.67fmol/L。结果表明，该方法在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种基于等温指数扩增的microRNA生物传感器。

背景技术

miRNA的异常表达与各种人类疾病(肝癌，肺癌，胃癌，结肠癌等)的发生和发展密切相关，并逐渐 成为潜在的肿瘤标志物。因此，miRNA的分析表达和有效检测对于理解其在癌细胞中的作用以及进一步验 证其功能的生物医学研究具有重要意义。传统方法包括实时聚合酶链反应，RNA印迹，微阵列和二代测序， 是目前检测microRNA表达水平的四种主要方法。但是，这些方法都存在一些固有的局限性。因此，为了 快速便捷地检测microRNA，陆续开发出各种策略，例如基于电化学的测定，基于表面增强拉曼光谱的测定， 纳米颗粒基于比色测定和荧光测定。但是，每种方法都有其缺点和局限性。

为了提高检测的灵敏度和适应性，已经开发了各种基于核酸序列的扩增策略，并且已被广泛地应用于 荧光、表面等离子共振、比色及电化学等传感平台，例如，链置换扩增、滚环扩增、环介导的等温扩增、 酶修复放大技术、催化发夹自组、杂交链式反应等。等温指数扩增反应因为具有高灵敏度，低成本和对临 床样品中抑制成分的良好耐受性，已被用作检测miRNA的替代扩增技术。SYBR Green I通常在等温指数 扩增分析中用作标记。但是，SYBR Green I与富含GC的序列的优先结合限制了其在多重PCR中的进一步 应用。催化发卡自组装是一种稳定、高效的无酶信号放大技术。在靶核酸存在的条件下，以核酸杂交作为能量，驱动两种发夹结构DNA催化自组装，源源不断地形成稳定的双链DNA，从而实现无酶核酸信号放 大为了。克服SYBR Green I的局限性，已将催化发卡自组装与分子信标相结合已成功应用于具有高灵敏 度和出色特异性的各种核酸的检测

受上述工作的启发，在本研究中，我们通过整合多种信号放大策略，构建了一种新型的miRNA检测方 法，结合链置换扩增、催化发夹自组装和等温指数扩增反应，开发出一种简单、灵敏且能快速检测microRNA 的生物传感器。

发明内容

目的是开发出一种简单、灵敏且能快速检测microRNA的生物传感器。

具体技术方案如下：

一种基于等温指数扩增和发卡探针的microRNA生物传感器，其制备方法包括以下步骤：

(1)、发卡探针的制备将分别装有HPLC纯化的HP1、HP2和荧光探针核酸链冻干粉的EP管以12000rpm 离心5分钟，在此EP管中分别加入180μL、180μL和300μL DEPC水配制成10uM的溶液。然后将此EP 管置于95摄氏度水浴箱中孵育5分钟，之后关闭水浴箱缓慢下降至室温，从而制备发卡结构探针，将装 有所述发卡探针的EP管用锡箔纸包裹后置于-20摄氏度保存。

(2)、指数等温扩增取上述制备的HP1、HP2和荧光发卡探针溶液各0.1μL、0.2μL和2μL与缓 冲液混合后得到50μL反应溶液，在反应液中加入待检microRNA，并于37摄氏度下反应90分钟，然后 80摄氏度下孵育20分钟。

(3)、信号检测将上述反应后的液体加入到100μL石英比色皿，将比色皿置于荧光分光光度计中， 将激发和发射的狭缝宽度设置为5nm，PMT检测器高电压设置为600v，以495nm的光激发样品，并以1nm 的步长从510nm至650nm扫描荧光发射检测荧光信号。这样就建立起基于指数等温扩增的microRNA生物 传感器