[发明专利]一种用于PK15细胞培养的无血清培养基及其应用

说明书

本发明涉及一种用于PK15细胞培养的无血清培养基，包含无血清基础培养基和添加物，所述添加物为KGF活性短肽（氨基酸序列为KGHLLMF）和花生蛋白酶解物。所述添加物可显著促进悬浮培养PK15细胞的生长、高存活率以及保持培养的猪圆环病毒高滴度。本发明所述培养基可实现PK15细胞全悬浮无血清培养，且无需微载体，即可以实现大规模高密度培养，使用所述培养基可获得高滴度的猪圆环病毒。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，更特别地，涉及一种用于PK15细胞培养的无血清培养基及其应用。

背景技术

猪肾上皮细胞（Porcine Kidney，PK15细胞）属于上皮样细胞，可以连续传代。PK15细胞体外培养呈上皮样贴壁细胞，该细胞对多种病毒比较敏感，如猪圆环病毒 (PCV)、猪瘟病毒 (CSFV)、猪细小病毒 (PPV) 等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗、猪细小病毒疫苗等的制备。

PK15细胞通常用于生产猪圆环灭活疫苗，猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)在分类上属圆环病毒科、圆环病毒属。PCV不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞，其抗血清不能抑制猪细小病毒 (PPV)对红细胞的凝集性。在临床上主要表现为断奶后仔猪多系统衰弱综合症 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS) 和猪皮炎与肾炎综合征 (PDNS)。除 PMWS 外，PDNS、PNP(增生性坏死性肺炎)、PRDC(猪呼吸道疾病综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等相关的猪病，死亡率10％～30％不等，较严重的猪场在暴发时死淘率高达 40％，给养猪业造成严重的经济损失。

目前对于PK-15细胞的传统培养方式是贴壁培养，通常在生长及维持培养基中需要加入10％-20％的动物血清，以提供细胞生长所需的营养成分及细胞保持正常形态的支持蛋白。现使用PK15细胞生产猪圆环病毒大多采用滚瓶培养，细胞扩增阶段使用8%-10%牛血清，达到一定细胞密度后接毒，采用1%-2%的低血清培养基维持培养或连续传代培养。类似工艺的弊端是多方面的：

（1）.培养阶段血清浓度高，细胞培养结果容易有批间差异；

（2）含血清工艺可能带来外源病毒、支原体污染等安全问题，因此对于血清质量要求更高；

（3）.培养过程需要复杂的消化过程，即使采用微载体培养，因为细胞消化及重新均匀贴壁，球转球有较大难度。；

（4）.目前全球血清供应趋紧，这大大影响了疫苗企业的生产效率。因此尽量少用血清或者不用血清已成为 PK-15 细胞培养的发展趋势。

低血清与无血清细胞培养技术的研究与应用已被列入国家科技支撑计划重点项目。 2010年以后，美国、欧盟和日本等国家逐渐停止在生物制药中应用血清，FDA也停止 含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。

相对于动物细胞贴壁培养而言，单个细胞悬浮培养具有细胞生长均一性好、传质效率高、容易实现规模放大和过程控制的特点。哺乳动物细胞的悬浮培养己成为目前动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择，超过80%的哺乳动物细胞表达生物技术药物采用动物细胞悬浮培养为其生产工艺。对于PK15细胞悬浮培养而言，要在规模化的培养中获取好的培养结果，设计出适宜细胞悬浮生长的培养基是至关重要的。

开发PK15细胞无血清无微载体悬浮培养工艺以及相应培养基有极其重要的意义。现有技术中，用于培养PK15细胞的培养基，绝大部分为有血清培养基，目前主要用于PK15细胞的贴壁培养，比如转瓶或微载体培养工艺中。血清的批间差异，造成转瓶和微载体生产的疫苗在细胞质量、病毒产量和滴度方面产生较大的批间差异，而且血清的动物源性也带来了外源病毒污染的高风险性。