[发明专利]生产胞嘧啶的重组微生物及生产胞嘧啶的方法

说明书

本发明提供了生产胞嘧啶的重组微生物，所述重组微生物其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli.)，该菌株已于2019年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.17730。所述生产胞嘧啶的重组微生物经发酵，得到所述胞嘧啶；或通过在胞苷发酵液中或含胞苷的溶液中加入核苷水解酶生产胞嘧啶。

本申请是申请号为：201910602231.2、发明创造名称为：生产胞嘧啶的重组微生物及生产胞嘧啶的方法、申请日为：2019年07月05日的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及生物发酵法和酶法生产胞嘧啶的方法。主要是生产胞嘧啶的重组微生物的构建和发酵生产方法的建立，其次是利用基因工程微生物生产胞苷水解酶液，然后利用该酶液来水解胞苷制造胞嘧啶的方法。

背景技术

胞嘧啶是核酸中嘧啶型碱基之一，学名为4-氨基-2-羰基嘧啶，CAS RN:71-30-7,分子式:C₄H₅N₃O。白色或类白色结晶性粉末，常温下在水中的溶解度低，水微溶于乙醇，不溶于乙醚。

胞嘧啶是精细化工、农药和医药的重要中间体，特别在医药领域，主要用于合成抗艾滋病药物及抗乙肝药物拉米夫定，抗癌药物吉西他宾、依诺他宾、5-氟胞嘧啶等等。目前国内外对胞嘧啶是通过化学法来合成的，主要的生产集中在国内。胞嘧啶是一个含碳和氮的杂环化合物，在化学合成过程中需要使用到强碱和有机溶剂，导致废水处理难度大。随着国家对化工合成环保要求的提高，国内企业开始停止化工合成法生产胞嘧啶，或将生产转移到对环保要求不高的地区。因此需要开发一种能替代化学合成、降低污染的胞嘧啶生产方法。

人类已经利用微生物来发酵生产核苷类的产品，如β-胸苷、鸟苷、肌苷和腺苷，但胞苷、胞嘧啶等没有实现微生物法工业生产。本公司在前期研究中，利用基因工程改造技术，首次报道了利用生物法生产胞苷(专利申请号：201710003833.7)，构建得到的重组菌株在5L发酵罐可以生产胞苷35g/L。本发明是在前期工作的基础上，对胞苷生产菌进行进一步的改造，期望实现胞嘧啶的生物法生产。

发明内容

发明目的：(1)能够生产胞嘧啶的基因工程菌种的构建；(2)提供转化胞苷来生产胞嘧啶的酶，构建基因工程菌种生产相关酶液和转化胞苷生产胞嘧啶的方法。

技术方案：

申请人在国内专利申请(申请号201710003833.7)中提供了能够发酵生产胞苷的重组微生物，以大肠杆菌基因工程菌为例，本发明是在该菌的基础上改造成新的重组大肠杆菌生产胞嘧啶，满足工业发酵生产胞嘧啶的需要，提供了一条最佳的胞嘧啶生物合成途径，达到胞嘧啶的工业发酵生产的最低成本。既然上述专利申请(申请号201710003833.7)中大肠杆菌基因工程菌可以发酵生产胞苷，那么最简单的方法是利用上述重组微生物进行发酵，在发酵结束时，或获得纯化的胞苷后，通过核苷水解酶水解胞苷生成胞嘧啶和核糖。然而，所产生的核糖的市场小，核糖没有销量，副产物核糖还会导致处理的成本和时间增加。因此，本发明考虑在重组大肠杆菌发酵时直接产生胞嘧啶，同时使副产物进一步被利用而不积累副产物核糖。