[发明专利]一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法

说明书

一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，本发明涉及一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法。本发明的目的是为了解决现有检测sgRNA的在靶活性与脱靶效应的方法复杂，准确性低的问题，本发明基于体内脱靶检测GUIDE‑seq开发了高通量的细胞内脱靶检测手段。具体方法为：1.针对目标基因设计sgRNA；2.合成sgRNA文库；3.将sgRNA文库克隆到带有SpCas9表达蛋白的质粒上；4.文库细胞转染；5.GUIDE‑seq建库测序。本发明检测结果更加精确，文库大大减小，在保证检测准确性的同时大大减少实验的复杂性，本发明应用于体内在靶活性评估及脱靶检测领域。

技术领域

本发明涉及一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法。

背景技术

CRISPR-Cas9系统源自细菌及古生菌的获得性免疫系统，由于操作简单高效而成为一种强大的基因编辑工具。相对于ZFN、TALEN等基因编辑技术来说，其更加简单、经济、容易操作，令其成为迄今为止最为有效、低廉和容易的基因编辑方法，其在基因编辑(包括基因敲除、敲入、点突变)、基因治疗(镰状细胞贫血HBB基因修复等)、活细胞成像(如Cas-FISH)、功能基因筛选(CRISPRi/a正负向筛选)、靶向捕获(CRISPR-capture)等方面具有极重要的应用意义。但是，在其广泛应用的背后，CRISPR/Cas9系统有一个致命的缺点——容易脱靶，即在预期靶点以外的位点上产生额外的DNA剪切或编辑。

脱靶效应验证影响了CRISPR基因编辑工具的常规应用和临床治疗效果。目前也开发出了多种基因编辑脱靶检测手段，例如体外脱靶检测的SITE-seq，CIRCLE-seq，DIG-seq等，体内脱靶检测的GUIDE-seq，DISCOVER-seq等。但是这些脱靶检测方法都是每次只能检测一条sgRNA的脱靶，不仅耗时耗力而且成本昂贵。CRISPR文库筛选在药物发现、靶向基因调控、表观遗传调控、染色质操纵和活细胞染色质成像等广泛领域具有巨大的潜力。但是由于无法确定哪个sgRNA是真正能发挥作用的，因此只能每个基因设计多条靶向sgRNA(目前的文库一般是2-10条)。但是这会有很多缺点，首先是会导致文库大小很大，进而让实验变得困难和不确定性增加，成本昂贵，耗时耗力。其次是不同的sgRNA切割和脱靶效应不同，脱靶效应会导致筛选结果不准确及不可靠。因此，如何筛选出针对每个基因最优的sgRNA(切割效率最高，脱靶效应最少或者无脱靶)，构建出精准且小巧的CRISPR筛选文库至关重要。不仅能节约成本，还能保证数据的准确性。

另外，随着基因编辑临床转化的火热进行，CRISPR的安全性及效性始终是我们关注的重点。有效性的影响因素之一为靶点的基因编辑的效率，也就是其在靶活性。sgRNA的在靶活性越高，其基因治疗越有效。另外安全性也是临床临床转化过程中的另一个阻碍，尤其是“脱靶毒性”引起的安全性问题。脱靶毒性是指由于脱靶反应引起的细胞毒性，可以偏离靶点进行基因编辑导致基因突变、染色体缺失、甚至癌变的风险。因此如何降低脱靶毒性也是要解决的关键问题。在临床前可以针对靶点基因筛选出切割效率最高、脱靶效应最低的sgRNA，并且同时也可鉴定出其潜在脱靶位点，进而最大程度保证安全有效性的同时，实时监控潜在脱靶位点是否发生脱靶，为基因编辑临床治疗保驾护航。然而，如何快速、高效、准确的筛选出最优的sgRNA用于基因治疗，这是亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测sgRNA的在靶活性与脱靶效应的方法复杂，准确性低的问题，提供一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法。

本发明一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，按以下步骤进行：

一、针对靶基因设计并合成sgRNA文库寡核苷酸片段；

二、PCR扩增sgRNA文库，然后纯化，得到扩增纯化后的sgRNA文库；

三、将扩增纯化后的sgRNA文库克隆到带有SpCas9蛋白表达质粒上，构建CRISPR文库；