[发明专利]一种伯克霍尔德菌及其应用

权利要求书

1.一种伯克霍尔德菌，保藏编号为CCTCC NO：M2020510。

2.根据权利要求1所述的伯克霍尔德菌，其特征在于，16S rDNA如SIPO序列表所示。

3.根据权利要求1所述的伯克霍尔德菌在生产天然香料圆柚酮的应用。

4.一种保藏编号为CCTCC NO：M2020510的伯克霍尔德菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从湖北省柑橘工程技术研究中心取10g土样，将土样加到90g的灭菌生理盐水中混匀；

(2)取2mL混匀的液体于100mL最小培养基中，并添加1mL瓦伦西亚烯，37℃下震荡培养2-7天；

(3)将(2)获得的菌液用灭菌后的生理盐水稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6共6个稀释梯度，将各个梯度菌液涂布平板分离菌种，37℃培养直至菌落完全生长；

(4)待(3)中菌落长出后，选择适宜浓度的平板挑取单菌落，将单菌落接种于LB培养基中活化培养；

(5)初筛：取适量活化培养的菌液于最小培养基中，并添加1％瓦伦西亚橘烯，37℃下震荡培养，每隔12h测一次菌液OD₆₀₀值，绘制菌株的生长曲线；

(6)根据(5)绘制的生长曲线，选取生长良好的菌株转接至LB培养基中活化培养；

(7)取1mL菌液于100mL LB培养基中，37℃下震荡培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6-0.7时，添加0.1％瓦伦西亚橘烯，继续培养至72h；

(8)复筛：分别取培养24h、48h、72h的发酵液进行SPME-GC-MS检测分析，检测菌种转化生成圆柚酮的产量；

(9)选择圆柚酮产量高的菌株进行平板划线分离，连续分离3次。挑取平板上的单菌落于LB培养基中活化培养；

(10)取1mL菌液转接至100mL LB培养基中，37℃下震荡培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6-0.7时，添加0.1％瓦伦西亚橘烯，继续培养至72h；

(11)分别取培养24h、48h、72h的发酵液进行SPME-GC-MS检测，对转化产物进行测定分析；

(12)参照《常见细菌系统鉴定手册》通过形态学观察菌株在固体培养基上的菌落形态，同时对菌株进行多项生理生化指标测定。

(13)提取菌株的DNA，进行16S rDNA的PCR扩增与测序，并进行菌株的同源性分析。

5.一种含有圆柚酮的香料，其特征在于，所述圆柚酮由保藏编号为CCTCC NO：M2020510的伯克霍尔德菌生物转化得到的。

6.根据权利要求4所述的伯克霍尔德菌的筛选方法，其特征在于，所述的步骤(2)中最小培养基包括：6g/L Na₂HPO₄、0.50g/L NaCl、3g/L KH₂PO₄、1g/L NH₄Cl，并溶于0.85％生理盐水中。

7.根据权利要求4所述的一种生物转化生产天然香料圆柚酮的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中LB培养基成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl，溶于蒸馏水。

8.根据权利要求4所述的一种生物转化生产天然香料圆柚酮的方法，其特征在于，所述的所有步骤操作均在无菌操作台中进行。