[发明专利]减毒鼠伤寒沙门菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种减毒鼠伤寒沙门菌，其特征在于：所述减毒鼠伤寒沙门菌缺失自有fnr基因、arcA基因和fliC基因，所述减毒鼠伤寒沙门菌的分类命名为Salmonella enterica SLT39,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2020499，保藏时间为：2020年9月14日。

2.权利要求1所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，采用自杀质粒同源重组方法，缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028的fnr基因、arcA基因和fliC基因。

3.根据权利要求2所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，所述自杀质粒同源重组方法包括以下步骤：

(1)分别构建自杀质粒pRE112-Δfnr、pRE112-ΔarcA和pRE112-ΔfliC；

(2)将步骤(1)构建好的自杀质粒转入感受态大肠杆菌后与鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株进行接合转移，筛选阳性菌落，然后将阳性菌落置于培养基中增殖培养；

(3)通过PCR筛选得到同时缺失fnr基因、arcA基因和fliC基因的突变菌株ATCC14028。

4.根据权利要求3所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，自杀质粒的构建方法为：

(1)突变引物设计：根据Genbank公布的来源于鼠伤寒沙门菌ATCC14028全基因组序列，设计用于分别扩增fnr基因、arcA基因和fliC基因的上、下游同源臂的引物；

(2)上、下游同源臂的扩增：采用步骤(1)的引物通过PCR分别对fnr基因、arcA基因和fliC基因的上、下游同源臂进行扩增，得到扩增产物；

(3)上、下游同源臂的融合：将步骤(2)所得的扩增产物采用引物和高保真酶进行PCR扩增，得到融合片段；

(4)酶切处理：分别用KpnI和SmaI酶酶切步骤(3)所得的融合片段和pRE112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段；

(5)连接：利用连接酶将步骤(4)酶切后的融合片段与pRE112质粒连接，过夜，转化SM10λpir大肠杆菌感受态细胞中，待其长出后，进行PCR鉴定，获得阳性重组自杀质粒pRE112-Δfnr、pRE112-ΔarcA和pRE112-ΔfliC。

5.根据权利要求4所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，每种基因各设计两对扩增引物。

6.根据权利要求5所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，所采用的引物序列如SEQ ID NO.1-12所示。

7.根据权利要求4所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA 1μl，2×prime STAR Max 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddH₂O 22μl；扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 15s；30个循环后，72℃延伸5min。

8.权利要求1所述的减毒鼠伤寒沙门菌在制备疫苗中的应用。