[发明专利]一种生产L-瓜氨酸的基因工程菌株及其应用

说明书

本发明提供一株高效稳定生产L‑瓜氨酸的基因工程菌株CIT 4，该菌株是以大肠杆菌为宿主，首先使宿主缺失精氨基琥珀酸合酶活性，以阻断L‑瓜氨酸降解为精氨酸琥珀酸；还在宿主基因组上整合了编码大肠杆菌精氨基琥珀酸合酶的基因argG，并由色氨酸启动子P_trp进行表达调控；还使宿主缺失乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶活性；还在宿主基因组上整合了谷氨酸棒杆菌编码谷氨酸乙酰基转移酶的基因argJ，以此加强由谷氨酸合成乙酰谷氨酸过程中的代谢流量；还在宿主基因组上整合了枯草芽孢杆菌突变株A260编码氨甲酰磷酸合成酶两个亚基的基因pyrAA、pyrAB，以解除精氨酸对氨甲酰磷酸合成酶的反馈抑制，提高前体物质氨甲酰磷酸的供应。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种生产L-瓜氨酸的基因工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-瓜氨作为一种非蛋白质α-氨基酸，具有重要的生化和生理学功能。目前，L-瓜氨酸已在医药、工业、食品、化妆品、畜牧业等领域有广泛的应用，具有重要的经济和社会价值。L-瓜氨酸的生产方法主要包括化学合成法、酶催化法、微生物发酵法。化学合成法主要是将L-精氨酸在碱性条件下水解直接得到L-瓜氨酸。此法产率较低，环境污染大，而且生产过程中容易产生D型旋光对映体，造成后期产品分离纯化成本很高，因此化学合成法很难投入到实际应用中；酶催化法主要是以L-精氨酸为底物，利用精氨酸脱亚胺酶一步酶促反应直接将底物转变为L-瓜氨酸。但是精氨酸脱亚胺酶普遍具有稳定性不高的特点，难以实现酶的重复利用，而且在生产过程中需要耗费大量的发酵原料，工业成本较大，限制了酶催化法生产L-瓜氨酸的工业化应用；微生物发酵法是通过诱变筛选出高产型突变株或者通过代谢改造模式菌株实现以廉价碳源直接发酵生产L-瓜氨酸的目的，采用发酵法生产L-瓜氨酸生产工艺相对简单、对环境影响相对较小、产品纯度高，适合大规模工业生产。

由于L-瓜氨酸合成代谢途径中存在诸多反馈调控，整个合成途径很长，并且合成L-瓜氨酸所需前体物涉及到的代谢网络复杂，因此最初利用微生物发酵法生产L-瓜氨酸的工业生产菌株主要采用传统诱变结合结构类似物抗性筛选的方法获取。研究策略集中在筛选结构类似物突变体，以解除L-瓜氨酸合成过程中的反馈调控，提高胞内L-瓜氨酸的积累量。其中，Okumura Shinji等经过X射线逐级诱变筛选到一株精氨酸需求型突变菌株(US3282794)，经过96h发酵培养，L-瓜氨酸氨酸的积累量为19g/L。但是经过诱变筛选得到的生产菌株，存在遗传稳定性差，容易产生回复突变等缺点很难投入到大批量工业生产中。

随着基因工程技术的飞速发展，运用代谢工程技术构建L-瓜氨酸生产菌株的方法逐渐替代了传统诱变育种方法。谷氨酸棒状杆菌作为传统的氨基酸发酵生产菌株，其胞内摄取的葡萄糖经过糖酵解途径生成谷氨酸的代谢流量较强，而谷氨酸作为L-瓜氨酸合成的主要的前体物之一，因此谷氨酸棒状杆菌作为构建L-瓜氨酸生产菌株的主要选择。谢红翠等以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，敲除L-瓜氨酸降解相关基因argG，然后将合成L-瓜氨酸的基因簇argCJBDF连接到组成型载体pXMJ19-lacI上，并将其导入谷氨酸棒状杆菌中(DOI:10.3969/j.issn.1671-7627)。该菌株经过72h摇瓶发酵后，L-瓜氨酸产量为4.33g/L。Hao等以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，通过敲除L-瓜氨酸降解的基因argG及编码阻遏蛋白的argR基因，并在此基础上导入重组质粒pXMJ19-argJ，以增强鸟氨酸乙酰基转移酶的表达(DOI:10.1007/s10295-014-1561-x)。最终经过72h摇瓶发酵后，L-瓜氨酸的积累量为8.51g/L，对该菌株进行摇瓶发酵培养条件优化(DOI:10.3969/j.issn.1672-3678)，经摇瓶培养72h后该菌株L-瓜氨酸的积累量为14.96g/L。上述生产菌株普遍存在生产周期长，生产强度低，生产易波动，菌体生长受限等问题，而且发酵过程中需要额外添加精氨酸，造成生产成本过大，同时在菌株构建过程中采用将L-瓜氨酸合成关键基因连接到表达载体上以提高关键酶的转录量，在生产过程中表达载体容易丢失或者需要加入一定的选择性压力，限制了菌株的工业化应用。