[发明专利]一种基于片段化萤光素酶-DNA嵌合体互补的发光体系、构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于片段化萤光素酶‑DNA嵌合体互补的发光体系、构建方法及其应用。所述发光体系由萤光素酶大亚基‑DNA嵌合体、萤光素酶小亚基‑DNA嵌合体和实现上述两种嵌合体互补发光的单链DNA模板组成。本技术方案提供的片段化萤光素酶‑DNA嵌合体互补发光系统可针对核酸产生高信噪比的发光传感信号。通过该系统可实现不同microRNAs标志物的高灵敏度、高特异性检测，并且检测信号的读取仅需一部未经任何硬件改造的智能手机即可完成。因此，本发明提供的技术具有操作简便、成本低廉、不依赖于专业人员的优势。

技术领域

本发明属于生物医学分析领域，尤其涉及一种基于片段化萤光素酶-DNA嵌合体互补的发光体系、构建方法及其应用。

背景技术

存在于人体外周血中的microRNAs(miRNAs)是肿瘤等重大疾病早期诊断的关键标志物。目前，在miRNAs检测中应用的主要技术包括：Northern blot、DNA微列阵、实时荧光定量聚合酶链式反应等。然而，上述技术的实现需要配备昂贵的大型仪器设备和专业化的检测人员，同时检测过程往往涉及较为复杂的操作流程。以上问题制约了miRNAs检测技术的临床转化。

片段萤光素酶互补发光是近年来建立的生物医学分析技术。该技术无需外部光源激发即可产生检测信号，具有信噪比高、对检测设备要求较低的优点。虽然萤光素酶互补发光已在蛋白质检测领域得到了一定的应用，但是尚未涉及核酸尤其是miRNAs的检测。造成上述问题的主要原因在于，片段化的萤光素酶蛋白无法直接与核酸靶标进行结合并产生检测信号。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的在于提供一种基于片段化萤光素酶-DNA嵌合体的互补发光技术，以及该技术在miRNAs标志物检测中的应用；所述技术可实现片段化萤光素酶对核酸的高信噪比传感，进而实现多种miRNAs的高灵敏度、高特异性的通用化检测；此外，检测信号的读取仅需一部廉价的智能手机即可实现，具有操作简便、成本低廉的优势。

本发明的技术方案为一种基于片段化萤光素酶-DNA嵌合体互补的发光体系，包括以下三个部分：萤光素酶大亚基-DNA嵌合体、萤光素酶小亚基-DNA嵌合体和实现上述两种嵌合体互补发光的单链DNA模板。

其中，所述萤光素酶大亚基-DNA嵌合体由融合有SNAP-tag的萤光素酶大亚基和单链DNA探针Probe1组成；所述融合有SNAP-tag的萤光素酶大亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述单链DNA探针Probe1的序列如SEQ ID NO.2所示。

而且，所述融合有SNAP-tag的萤光素酶大亚基的基因编码序列如SEQ ID NO.6所示。

其中，所述萤光素酶小亚基-DNA嵌合体由融合有SNAP-tag的萤光素酶小亚基和单链DNA探针Probe2组成；所述融合有SNAP-tag的萤光素酶小亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述单链DNA探针Probe2的序列如SEQ ID NO.4所示。

而且，所述融合有SNAP-tag的萤光素酶小亚基的基因编码序列如SEQ ID NO.7所示。

其中，所述实现上述两种嵌合体互补发光的单链DNA模板的序列如SEQ ID NO.5所示。

一种片段化萤光素酶-DNA嵌合体的构建方法，包括以下步骤：

步骤1.大肠杆菌蛋白质表达体系的制备：通过基因合成技术分别合成融合有SNAP-tag的萤光素酶大亚基或融合有SNAP-tag的萤光素酶小亚基编码序列，并将其插入质粒载体pET-26(b+)中，所得重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株；