[发明专利]一种非接触式空间超分辨相干拉曼光谱成像方法

说明书

本发明提供了一种突破光学衍射极限的非接触式无标记空间超分辨相干拉曼光谱成像方法。方法通过“泵浦‑耗尽‑探测”的光学测量方式，解决光学衍射效应对空间分辨率的限制，并利用超短脉冲激发相干拉曼过程，结合双光梳“泵浦‑探测”的宽带光谱测量方式，实现空间超分辨成像与宽带相干拉曼光谱测量的统一，最终实现对样品表面的非接触式超分辨相干拉曼光谱成像。

技术领域

本发明涉及拉曼光谱测量与成像领域，尤其涉及一种非接触式空间超分辨相干拉曼光谱成像方法。

背景技术

相干拉曼光谱测量与成像技术是研究分子物理特性、化学反应动态过程、生物微观结构的重要手段，是无标记、高分辨生医成像的技术基础，同时也为工业活动提供了一种非接触式光学检测方法，因此具有极其重要的科学价值与应用前景。

相干拉曼光谱技术主要包括相干反斯托克斯拉曼技术(CARS)和受激拉曼光谱技术(SRS)；其基本原理是通过多光子过程诱发分子的振动能级跃迁，并辐射出频率蓝移的反斯托克斯光(CARS)或引发激发光强度的涨落(SRS)；特点是信号具有极好的时间与空间相干特性。该特点使其探测方向上的拉曼信号强度相对于普通拉曼散射有了数量级的提升，因此相干拉曼技术也是弱信号探测和成像的重要手段。

此外，与检测分子偶极矩变化的红外光谱不同，相干拉曼过程主要基于分子振动时产生的极化率变化，因此在很大程度上不会受到水分子吸收效应的影响，更适合于活体生物细胞(组织)成像诊断和工业过程的光学监测。

相干拉曼光谱与成像技术通过测量分子(或化学键)的拉曼特征谱线(指纹光谱)来实现对目标物质的识别和定性、定量分析。然而，对于复杂分子体系(如生物细胞、DNA)而言，分子或化学键的指纹峰分布情况错综复杂，且在分子间相互作用或环境作用下存在峰位移动的情况，因此通过对单一指纹峰的测量无法准确判断分子的种类、状态及其动态过程。

另一方面，拉曼成像的空间分辨率是决定其在化学、生物医学等领域的应用价值的关键因素。目前的空间超分辨成像主要依赖于荧光标记方法，和基于纳米结构的表面增强拉曼技术。基于荧光标记法的技术主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术，适用范围有限，且无法提供宽带分子特征光谱信息。基于纳米结构的表面增强拉曼技术可以实现近场超分辨分子成像，但是实施条件苛刻，且探针必需与物质表面接触。这种方式不可避免地增加了样品制备的难度，且对目标样品的选择具有明显地局限性，因此很大程度上限制了其在生物医学研究中的应用。

综上所述，目前的超分辨光学诊断技术难以摆脱对接触式探针或荧光标记物的依赖，且无法做到宽带分子指纹光谱测量与超分辨光学成像的统一。

发明内容：

针对上述现有技术的缺点，提出了一种非接触条件下实现突破光学衍射极限的空间超分辨相干拉曼光谱成像方法。方法通过“泵浦-耗尽-探测”的光学测量方式，解决光学衍射效应对空间分辨率的限制，并利用超短脉冲激发相干拉曼过程，结合双光梳“泵浦-探测”的宽带光谱测量方式，实现空间超分辨成像与宽带相干拉曼光谱测量的统一，最终实现对样品表面的非接触式超分辨相干拉曼光谱成像。

本发明目的实现由以下技术方案完成：

本发明提供了一种非接触式空间超分辨相干拉曼光谱成像方法，利用两台重复频率有微小差别(重复频率差小于1kHz)的飞秒光梳作为光源，其中一台光梳，分成两路，分别作为泵浦光和“耗尽”光，且两路光之间存在延时t；另一台光梳用作探测光。“耗尽”光经过一个相位板，形成空间分布为圆环状的光斑。三束光共线，并通过显微物镜聚焦于待测样品表面；利用“泵浦-耗尽-探测”构架，产生突破光学衍射极限的光斑照亮样品；利用相干拉曼过程，产生波长蓝移的反斯托克斯光；利用双光梳“泵浦-探测”技术，实现相干拉曼光谱的快速测量；利用点扫描的方式，实现样品表面的超分辨高光谱成像。

具体来说：