[发明专利]一种水稻细菌性条斑病的感病基因OsHXK5及其应用

说明书

本发明公开了一种水稻细菌性条斑病的感病基因OsHXK5及其应用，所述水稻细菌性条斑病菌的感病基因OsHXK5基因特征在于基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用CRISPR/Cas9技术在水稻中定点突变OsHXK5基因启动子区的靶标序列，选育抗细条病菌水稻，所述靶标序列如SEQ ID No.2所示。致病实验表明用本发明方法选育的抗病的水稻NH，对水稻细菌性条斑病菌的抗性明显增强。在实际应用中OsHXK5基因可作为基因编辑靶标用于培育抗细菌性条斑病水稻新种质，本发明提供的抗病育种方法可用于研发和构建抗病水稻，可广泛应用于农业生产中的抗病育种。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种水稻细菌性条斑病的感病基因OsHXK5及其应用。

背景技术

由水稻黄单胞菌属条斑病致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，以下简称Xoc)引起的水稻细菌性条斑病，是危害水稻生产的重要细菌性病害之一。该病害在我国秦岭、淮河以南稻区广泛流行，通常导致水稻减产5％～20％，较为严重时可达到40％～60％，且近年来，该病大量出现在我国的东南部沿海地区并有逐渐蔓延的趋势，是我国检疫性病害。目前我国的农业生产主要还是依赖农药来防治该病，但使用农药进行防治只能暂时减轻细菌性条斑病的危害，且成本高、污染重、安全性低。病菌长期面对药剂压力必定会发生变异，使农药效果降低。培育和种植抗性品种是防治水稻细菌性条斑病最经济有效的手段。

植物中的感病基因是病害发生的关键基因，其在与病原细菌的效应蛋白直接接触后会过量表达，随后激活植物的整个感病通路，最终导致植物发生病害。转录因子类似效应蛋白(Transcription activator like effector，简称TALE)是Xoc中一类重要的毒性因子，其通过III型分泌系统进入水稻细胞后结合到特定感病基因(Susceptible gene,简称S基因)启动子区的EBE(Effector binding element)序列而激活S基因的表达。在先前的研究中，并没有任何Xoc中Tal10a靶向OsHXK5基因启动子区的报道。而这一发现，可以让我们通过日前已经初步成熟的基因定点编辑技术(CRISPR/Cas9)对感病基因的启动子区进行修饰，从而培育抗性水稻。

CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是来自原核生物的获得性免疫系统。近年来被发展为对基因组进行定点编辑的新技术，在多种领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/Cas9系统通过导向RNA(guide RNA,gRNA)锚定基因组特定序列，Cas9蛋白对该特定序列进行切割产生双链断裂，细胞启动DNA损伤修复机制，借助非同源末端连接或同源重组方式引入突变。目前，仍无运用该技术突变水稻OsHXK5感病基因启动子区来获得细菌性条斑病抗性水稻的报道。

发明内容

本发明基于转基因的基因定向敲除技术提供了水稻细菌性条斑病感病基因OsHXK5，以感病基因OsHXK5为靶点，利用CRISPR/Cas9系统定点编辑水稻OsHXK5基因启动子区培育广谱抗细菌性条斑病水稻品种。

为达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明以水稻细菌性条斑病菌Xoc和水稻互作转录组测序结果为基础，通过生物信息学预测和半定量RT-PCR验证，在日本晴中筛选了13个候选的Xoc GX01 TAL效应物靶基因。其中，Tal10a可与基因OsHXK5接合，并激活了该基因的转录。且申请人前期的实验结果证实了Tal10a对Xoc GX01的致病力起贡献。并利用构建的绿色荧光蛋白报告系统，确认了Tal10a在植物体内能与OsHXK5上游序列结合，激活下游基因的转录。

通过人工合成tal效应物的方法来诱导基因编辑水稻中的OsHXK5的表达，经证明所述的感病基因OsHXK5的过表达会导致水稻对细菌性条斑病感病。

所述的感病基因OsHXK5的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。