[发明专利]一种盐裂皮肤的制备方法和其间接免疫荧光检测方法

说明书

本发明涉及一种盐裂皮肤的制备方法和其间接免疫荧光检测方法，该盐裂皮肤的制备方法为取正常人皮肤，去除皮下脂肪，切成小块，在25℃室温条件下1mol/l NaCl浸泡20h‑24h，取出盐裂皮肤，吸干水分，用OCT包埋，切成厚度为6μm冰冻切片，置于‑80℃环境中保存备用。该盐裂皮肤的间接荧光检测方法为制备血清稀释液，滴加血清稀释液至盐裂皮肤切片上，然后，置于湿盒内孵育，孵育完成后，清洗，漂洗，吹干，得到免疫后的盐裂皮肤切片，用稀释后的山羊抗人FITC‑IgG、FITC‑C3和FITC‑IgA分别滴加到免疫后的盐裂皮肤切片上，置于湿盒内孵育，清洗，漂洗，吹干，置于荧光显微镜下观察，判断盐裂皮肤表皮侧或真皮侧是否有荧光物质呈线状沉积。本发明流程简单、耗时短，灵敏度高。

技术领域

本发明涉及一种医学检测技术，具体涉及一种盐裂皮肤的制备方法和其间接免疫荧光检测方法。

背景技术

盐裂皮肤-间接免疫荧光技术被广泛用于自身免疫性表皮下水疱病的检测, 该技术可将表皮和真皮在透明层下部进行分离，从而将基底膜带抗原分为表皮侧抗原和真皮侧抗原，其中BP180、BP230、整合素α6β4位于表皮侧，而VII型胶原、层粘连蛋白γ1、层粘连蛋白332位于真皮侧，可以根据盐裂皮肤-间接免疫荧光表皮侧或是真皮侧线状阳性的荧光模式，对自身免疫性表皮下水疱病进行初步分类。

传统制备盐裂皮肤的方法为：（1）取正常人皮肤，去除皮下脂肪，切成0.5cm ×0.5cm皮肤小块；（2）将切好的皮肤小块放入盛有1mol/l NaCl的烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上，在溶液中放入转子，整套装置放在4℃冰箱中；（3）调节磁力搅拌器转速，使皮肤小块轻轻飘起，低速旋转48h-72h；（4）用镊子轻轻夹持表皮，判断是否与真皮分离，若分离不理想，则放入烧杯中继续旋转；（5）取出盐裂皮肤，用滤纸吸干水分，OCT包埋；（6）将OCT包埋的盐裂皮肤，切成6μm厚的冰冻切片，-80℃保存。

该方法不仅步骤繁琐和耗时长，需要有专门的4℃冰箱及磁力搅拌器等仪器装置，而且旋转速度不易控制，物理旋转偏快，易导致表皮与真皮完全分离；物理旋转过慢，导致真表皮分离时间延长，或者盐裂皮肤分离不充分，从而影响盐裂皮肤底物的使用。

PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline），一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。

OCT包埋剂英文全称：optimal cutting temperature compound，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。又因OCT混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色。 利用OCT混合物（optimal cuttingtemperature compound）预先浸润组织，然后再进行恒冷箱切片，使切片质量得到改善。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种盐裂皮肤的制备方法和其间接免疫荧光检测方法，其具体技术方案如下：

一种盐裂皮肤的制备方法，包括以下步骤，

（1）取正常人皮肤，去除皮下脂肪，切成0.5cm×0.5cm皮肤小块；

（2）将切好的皮肤小块，浸没在盛有1mol/l NaCl的50ml离心管中，把离心管倒置于25℃的室温环境中，直接浸泡皮肤20h -24h，形成盐裂皮肤；

（3）取出盐裂皮肤，用滤纸吸干盐裂皮肤的水分，用OCT包埋盐裂皮肤；

（4）将OCT包埋的盐裂皮肤，切成厚度为6μm的盐裂皮肤-冰冻切片，置于-80℃环境中保存（不要超过半年）。

盐裂皮肤的间接免疫荧光检测方法，包括以下步骤，