[发明专利]一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法

权利要求书

1.一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步：重组质粒构建：通过基因合成技术将重组ACE2全长基因进行密码子优化后亚克隆到pcDNA3.1载体中，构建ACE2重组质粒；

第二步：转染：取密度为2.9×10⁶-3.1×10⁶/mL存活率为95-99％的Expi293细胞接种三角瓶；

用Opti-MEN Ⅰ稀释准备好的ACE2重组质粒，再用Opti-MEN Ⅰ稀释准备好的ExpiFectamin293Regent，室温静置4-6min；

将稀释后的ExpiFectamin293Regent加入至稀释后的ACE2重组质粒中，混匀2-3次后室温静置28-32min，得到混合物；

将混合物加入至事先备好的细胞中，在温度35-39℃、转速为110-130rpm、CO₂的浓度为6％-10％的培养箱中培养4-5天；

第三步：收样及纯化：收集培养基，利用SephroseG25对培养基进行缓冲液的置换后，再利用离子交换层析技术得到最终蛋白；

第四步：活性测定：利用Biacore检测最终蛋白的活性。

2.根据权利要求1所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，在第四步中,活性检测包括：配体偶联、重组ACE2重组质粒浓度、参数选择、分析模式。

3.根据权利要求2所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，配体偶联包括4通道偶联ACE2为3000RU；3通道偶联BSA为3000RU。

4.根据权利要求2所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，重组ACE2重组质粒浓度分别为0.03125ug/mL、0.0625ug/mL、0.125ug/mL、0.25ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL。

5.根据权利要求2所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，参数选择包括流速为30ug/mL、结合40s、解离300s、无需再生。

6.根据权利要求2所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，分析模式为1:1binding。

7.根据权利要求1所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，ACE2重组质粒蛋白序列为：

MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS*。