[发明专利]一种检测黄牛MFN1基因CNV标记的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测黄牛MFN1基因CNV标记的方法及其应用：以云岭牛的血样基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增MFN1基因CNV区域和参考基因BTF3的部分片段，根据2*log₂2^‑ΔΔCt将定量结果分为插入型、缺失型和正常型，从而鉴定云岭牛MFN1基因的拷贝数变异类型。与云岭牛生长数据的关联分析显示，MFN1基因不同拷贝数对个体生长发育有显著影响，其中缺失型个体的胸宽低于插入型个体。本发明在DNA水平上检测与牛生长性状密切相关的CNV标记，可作为生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于qPCR技术检测牛MFN1基因CNV标记的方法。

背景技术

随着基因组学和生物信息学等学科的发展，动物育种理论和技术正在发生重大变化，肉牛育种的方向由常规的表型选育向分子育种发展。目前，牛分子育种研究主要集中在以分子标记为基础的标记辅助选择方面。分子育种即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)作为一种基因组亚显微水平结构变异，具体是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间。全基因组范围内寻找CNV的方法主要包括比较基因组杂交(CGH)、SNP芯片和重测序。CGH是基于微阵列技术的比较基因组杂交，通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品(试验样本与对照样本)同时进行杂交，可检测试验样本基因组和对照样本基因组间DNA拷贝数的变化。CGH芯片的探针覆盖整个基因组，具有敏感度、准确度、分辨率高的特点，分析所得数据具有较高的可信度。然而CGH的分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出，同时CGH操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要大量的模板DNA，不利于大范围的推广。SNP芯片不需要同时使用两个样本的DNA和探针进行双杂交，仅使用单杂交就可以完成。它可以通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度，确定每个位点的相对基因组拷贝数。新一代直接测序技术克服了杂交固有的一些缺点，不需要更多的背景知识和设计工作，应用配对测序可以鉴定出复杂的结构变化。

对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。例如实时荧光定量PCR(qPCR)、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。qPCR根据所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。荧光染料嵌入法利用PCR反应体系中加入的过量的SYBR Green染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2^-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。荧光染料嵌入法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数。

线粒体融合蛋白(MFN1)基因调控细胞内线粒体外膜的融合，维持细胞中网状线粒体的动态需要。线粒体融合蛋白在N末端含有保守的催化GTP结合结构域，并通过C末端跨膜结构域锚定到外膜，线粒体融合蛋白通过GTP水解的同型和异型相互作用介导外膜融合。线粒体是所有真核生物都不可或缺的双层膜细胞器，大多数细胞中线粒体是高度动态的，且通过不断的融合、分裂来维持动态平衡。有研究指出，线粒体的快速融合与分裂是消除细胞内不正常线粒体的一种机制。

MFN1基因在线粒体新陈代谢中起着重要的作用，然而MFN1基因在牛肌肉发育中的作用尚未有研究报道。

发明内容