[发明专利]检测DSH基因突变的扩增引物、试剂盒及应用及方法

说明书

本发明涉及一种检测DSH基因突变的扩增引物、试剂盒及应用及方法，设计了一组多重的引物，结合多重PCR技术，扩增产物片段化后建库，应用Ion torrent PGM个体化基因组测序仪进行高通量测序，通过生物信息学分析获得ADAR1基因突变信息。本发明实现对15个外显子编码区的同步扩增富集，大大简化了实验操作，使每个样本的检测结果可以通过其标签序列找回，实现多样本、高通量化平行测序，提高了检测效率，降低了检测成本。本发明中设计优化的引物设计，采用30个PCR反应可以在单管中同步扩增获得ADAR1基因全部外显子序列及侧翼内含子序列，与芯片捕获技术相比，该方法操作简单、成本更低。

技术领域

本发明涉及医学分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测遗传性对称性色素沉着症致病基因突变的扩增引物、试剂盒及应用及方法。

背景技术

遗传性对称性色素异常症，又称对称性肢端色素沉着、对称性点状和网状白斑病，是一种罕见的远端四肢色素沉着性皮肤病，呈常染色体显性遗传。临床特征表现为肢端具有形状和大小不规则的对称性色素沉着斑和色素减色斑疹，呈网状图案，有些面部可见散在的雀斑样损害，通常于婴儿期或童年期发病。患者的色素型皮损往往可以持续终身，日晒后累计加重。位于染色体1q11-1q12上11.6 cM区段上ADAR1基因被鉴定为是该病的致病基因，ADAR1基因编码双链RNA特异性腺苷脱氨酶，此酶可以将腺苷转化为肌苷，破坏双链RNA的稳定性。ADAR1基因定位于1号染色体1q21.3，全长约40kb，相对分子量为39000，包含15个外显子，编码1226个氨基酸。结构上，ADAR1基因编码的蛋白包含有2个腺苷脱氨基酶（Z-alpha）区域、3个dsRNA结合区域（DRBM）、1个酶催化结构区域（ADEAMc），分别对应于第2外显子，第2-7外显子，第9-15外显子。现已发现200种以上的ADAR1基因突变位点，突变方式包括错义突变、无义突变、移码突变、剪切位点突变、单碱基插入/缺失变异等，其中以错义突变及无义突变最常见。该病具有高度遗传异质性，相同基因突变的不同患者发病龄、临床表型、严重程度、进展情况各不相同,且存在显著的地区和人种差异。ADAR1基因检测也有助于其直系亲属遗传咨询，并为再次生育产前检测提供依据。

基因诊断有助于患者皮肤病理诊断、遗传咨询和产前诊断等。大部分遗传性对称性色素异常症患儿在儿童期和青少年期发病，病情不断加重直至影响皮肤美观，同时，患者也非常关心兄弟姐妹以及后胎的健康问题。患者遗传学病因的确诊，为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。目前采用PCR扩增外显子及侧翼有限区域序列结合DNA测序的方法可明确90%左右的患者，仍有10%左右的患者不能明确病因，因此亟需能够特异性检测ADAR1全长基因的检测方法。鉴于ADAR1外显子与内含子较多，并具有高度遗传异质性，一代测序技术通量太低，耗时耗力，无法满足众多基因的测序和多样本的检测。

第二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)是对经典测序技术的一次革命性的技术更新，又称为高通量测序技术，该技术具有快速、准确、低成本的优点，可以实现对多个样本、多个基因、多个外显子的立体化检测。其中，Life Technologies公司2010年推出的的Ion torrent PGM测序平台是半导体芯片测序的代表，该技术在高密度分布的芯片微孔中固定DNA模板链，随后依次掺入核苷酸ACGT，当有配对的碱基掺入时，在DNA聚合酶的催化下，把4种dNTP中的一种聚合延伸到DNA链上完成延伸反应，释放出H+离子，导致反应池中pH值发生变化，位于池下的离子感应器收到此信号后，将化学信号转换成数字信号，从而读出DNA序列。与一代测序技术相比，Ion torrent PGM测序系统更简单、快捷，由于其检测设备无需光学检测和扫描系统，并且使用配套试剂为天然核苷酸和聚合酶，无需较为复杂的标记荧光信号的染料，Ion torrent PGM测序技术可以对PCR产物进行直接测序，不需要片段化处理，采用标签技术，不需要对每个样本单独建库，可以显著提高检测通量，降低单个样品的检测成本。目前还未有将多重PCR技术和Ion torrent PGM测序技术结合，并将其应用于ADAR1基因检测的研究。