[发明专利]一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法

说明书

本发明公开了一种基于RPA‑侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种基于RPA‑侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合包括2条引物PlRPA‑F和生物素标记的PlRPA‑R，以及1条探针PlRPALFD‑P。RPA检测引物与探针组合经过40℃恒温扩增后采用侧流层析试纸条检测，可观察到试纸条在检测区呈现出阳性条带。本发明公开的RPA‑侧流层析技术检测引物与探针组合及其检测方法能用于生产实践中荔枝霜疫霉感染植株及果实的快速、灵敏、准确的检测，同时能用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为荔枝霜疫霉引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis)是我国南方的一种名特优水果，栽培面积和年产量分别占世界的84.5％和70.5％，年总产值达到62.88亿元，为我国在世界上最具竞争实力的一种亚热带与热带水果。荔枝霜疫病目前是荔枝生产上的一种最重要的病害，其是由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchi)侵染引起的。它主要危害已近成熟的果实，也危害花穗、幼果、果柄、结果小枝和叶片，从而引起大量落花、落果、裂果及烂果，同时也是造成荔枝采后腐烂变质的重要因素。天气潮湿年份烂果率高达50％，损失率高达30％～80％，严重影响荔枝产量和鲜果品质，造成严重的经济损失。近几年该病有逐渐加重的趋势，已成为限制荔枝安全生产的重要障碍。因此建立荔枝霜疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及采摘果实进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况，及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失，尤其是荔枝采后储藏都具有重要的理论和实际意义。

疫霉菌传统的检测鉴定方法是以分离物形态学、生物学、致病性和生理生化特征指标作为依据，对照已有的研究数据确定其分类地位。但由于疫霉形态变异大，一些用于分类、鉴定的形态学特征易受环境条件和人为因素影响，存在不稳定性，特别是有些典型的形态学特征难以产生，使得传统鉴定十分困难。基于LAMP的恒温可视化检测技术已经成功用于荔枝霜疫霉的检测，但是其需要的恒温条件为60–65℃且反应时间在1小时以上，耗费时间较长，依赖专业的恒温装置，不能满足快速检测的需求。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase ploymerase amplification，RPA)技术是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、性价比高的特点。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在25℃～42℃等温条件下快速完成核酸扩增，产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测，也可以与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法相结合进行检测。

重组酶聚合酶核酸扩增技术(RPA)与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，LFD)结合应用形成的RPA-侧流层析体系经过恒温短时间扩增反应后，肉眼即可观察扩增产物在侧流试纸条上的检测结果，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测。目前RPA-侧流层析技术检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，但在植物病原卵菌检测中报道较少，尤其是对荔枝霜疫霉的检测国内外均未见相关应用报道。

因此，提供一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法，本发明的检测引物与探针组合特异性强、灵敏度高；检测方法简便快速，且结果可靠。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合，所述引物与探针核苷酸序列分别为：