[发明专利]合成α-熊果苷的基因工程菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种合成α‑熊果苷的基因工程菌株及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明利用表达蔗糖磷酸化酶(SmSP)的重组枯草芽孢杆菌全细胞催化生产α‑熊果苷，为α‑熊果苷的生产提供了新的思路和方法。本发明通过优化蔗糖磷酸化酶(SmSP)的表达载体以及启动子，提高了SmSP的表达量，α‑熊果苷的产量由原始菌株的10.6g/L提升至41.0g/L。由于质粒表达不稳定，本发明将优化后的基因表达框P43‑gtfA整合至B.subtilis WB600基因组，获得基因工程菌株BSP43‑SmSP。当底物HQ的浓度为50g/L，蔗糖浓度为310.9g/L，菌体浓度OD₆₀₀＝20，催化体系在摇瓶中30℃、220rpm催化20h时，该菌株α‑熊果苷的产量稳定，且相比对照提升至61.1g/L，底物对苯二酚的摩尔转化率为49.4％。

技术领域

本发明涉及一种合成α-熊果苷的基因工程菌株及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

α-熊果苷(4-氢醌-α-D-吡喃葡萄糖苷)是一种天然糖苷，包含1个葡萄糖基和1个酚基，之间通过α-1，4糖苷键相连。近年来，由于α-熊果苷有良好的对光辐射的耐褐变性和对酪氨酸酶的抑制活性，其在化妆品工业中被广泛用作美白剂。此外，α-熊果苷不仅可以减少皮肤色素的沉积，同时还有杀菌、消炎的作用，是一种新型的无刺激、无过敏的天然美白活性物质。目前合成α-熊果苷的方法有化学合成法、酶法合成以及发酵法。其中，化学合成法立体选择性差，产物大多都为混和物，不能制备单一的产物，并且反应过程所用的化学物质极易造成环境污染，也会存在消费者对产品有过敏反应等问题；发酵法生产α-熊果苷由于前期底物投入较多，底物转化率低，发酵周期较长，需要多种酶参与，且产量较低，因此不适用于大规模生产；而酶合成法副产物少，产物单一且易于分离提取，环境污染小，是目前生产α-熊果苷最常用的方法。

蔗糖磷酸化酶是一种同型二聚体的细胞内酶，属于糖基水解酶13家族。蔗糖磷酸化酶可在一步反应中将蔗糖转化为相应的糖基化产物，即将蔗糖的糖基转移至对应受体上，形成相应的产物。有研究表明，蔗糖磷酸化酶主要以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖为糖基供体，多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等多类物质均可以作为该酶的糖基受体。蔗糖磷酸化酶由于其广泛的受体特异性，因而在高效生产α-熊果苷方面具有很大的潜力。迄今为止，在许多细菌中都发现了蔗糖磷酸化酶的存在，其中来自变异链球菌(Streptococcus mutans)和青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶最稳定。

枯草芽孢杆菌作为一种对环境无害的(GRAS)革兰氏阳性细菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主及重要的模式菌株。

本实验室前期选用来源于变异链球菌的蔗糖磷酸化酶(SmSP)在枯草芽孢杆菌中进行异源表达，以蔗糖和对苯二酚(HQ)为底物，全细胞转化合成α-熊果苷(如图1所示)。然而现有的构建的异源表达蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌转化合成熊果苷的产量较低，不利于工业化生产。

因此，如何利用表达蔗糖磷酸化酶(SmSP)的枯草芽孢杆菌高效的催化合成α-熊果苷，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种合成α-熊果苷的基因工程菌株及其构建方法与应用，该基因工程菌株可以稳定且较高效的合成α-熊果苷。

本发明的第一个目的是提供一种合成α-熊果苷的基因工程菌株，所述的基因工程菌株是在枯草芽孢杆菌宿主中，以P43为启动子，异源表达蔗糖磷酸化酶。

进一步地，所述的异源表达为游离表达或整合表达。

进一步地，所述的游离表达是以pP43NMK-P43质粒为载体进行表达。

进一步地，所述的整合表达是将连接有P43启动子的蔗糖磷酸化酶基因片段整合至整合位点ganA基因上。