[发明专利]同时检测辣椒四种病毒的多重RT-PCR引物组及其方法

说明书

本发明公开了一种同时检测辣椒四种病毒的多重RT‑PCR引物组，引物对CMV‑F和CMV‑R为检测黄瓜花叶病毒的引物，引物对CHiVMV‑F和CHiVMV‑R为检测辣椒脉斑驳病毒的引物，引物对PVMV‑F和PVMV‑R为检测甜椒叶脉斑驳病毒的引物，引物对PMMoV‑F和PMMoV‑R为辣椒轻斑驳病毒的引物。本发明用四重RT‑PCR检测常见的4种辣椒病毒即黄瓜花叶病毒、辣椒脉斑驳病毒、甜椒叶脉斑驳病毒和辣椒轻斑驳病毒，与目前单重RT‑PCR和双重RT‑PCR检测方法相比，用一次RT‑PCR反应可检测4种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率进一步提高，检测的成本显著降低。

技术领域

本发明属于作物病毒检测技术领域，特别涉及一种同时检测辣椒四种病毒的多重RT-PCR引物组及其方法。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L.)是世界第三大蔬菜作物，也是我国种植面积和产值第一大蔬菜作物(郑井元等，2018)。在辣椒生产中，病害普遍成为阻碍椒农增收的主要障碍，病毒病是危害较大的病害之一(张竹青，2009)。病毒病常可导致辣椒减产30％～70％，且使其品质变劣，失去商品价值，成为影响辣椒产量和质量的主要因素之一。目前已知侵染辣椒的病毒不少于60种(Kenyon et al.，2014)，其中黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)等3大RNA病毒属中的病毒是中国辣椒生产中为害的主要病毒。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是Cucumovirus中的为害辣椒的主要病毒类型之一；辣椒脉斑驳病毒(Chilliveinal mottle virus，CHiVMV)和甜椒叶脉斑驳病毒(Pepper vein mottle virus，PVMV)是Potyvirus中为害辣椒的主要病毒类型；辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)是Tobamovirus中为害辣椒的主要病毒类型。随着全球气候环境变暖，全国各地辣椒病毒病有逐年加重的趋势，生产和育种中迫切需要准确、高效地鉴定病毒病的种类，以便为针对性地开展当地主要为害病毒的防治技术、抗病育种等工作提供指导。

传统的病毒检测和鉴定方法有生物学方法、电镜法、血清学法、反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-PCR，即RT-PCR)法等，生物学方法、电镜法、血清学法等检测方法均存在不足。首先，生物学方法耗时耗力、灵敏度差，不同病毒侵染后也常常表现出相似症状而影响鉴定的准确性。其次，电镜法需要昂贵的仪器，操作方法不易掌握，且对病毒属以下的分类不能判定。此外，血清学法容易出现假阴性或假阳性，且试剂盒的成本高。RT-PCR法具有灵敏度高、快速、特异性较强等其它检测方法所不能比拟的优点，已成为当前植物病毒病检测的首选方法。生产实际中往往是多种病毒复合侵染植株，可以通过多重RT-PCR法同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，大大提高了检测效率，也大幅降低了检测成本。目前，辣椒病毒单重RT-PCR检测研究较多，而多重RT-PCR研究仍然较少。虽然国内外对辣椒上的常见病毒开发出了一些多重检测方法，然而针对CMV，ChiVMV，PVMV，PMMoV四种病毒的多重RT-PCR检测技术没有报道过。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供一种高效的、同时检测辣椒中四种RNA病毒的四重RT-PCR检测引物及方法。针对国内发现的辣椒4种病毒，即黄瓜花叶病毒(CMV)、辣椒脉斑驳病毒(CHiVMV)、甜椒叶脉斑驳病毒(PVMV)和辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)，根据Genebank发布的这四种病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计引物，建立一个简单、高效、灵敏的四重RT-PCR检测技术体系以同时检测这四种病毒。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：