[发明专利]一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法

说明书

本发明公开了一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法，游离血红素以下简称FH，试剂由A液与B液组成。A液由过氧化脲、过氧化氢组成；B液由3，3’，5，5’‑四甲基联苯胺、二甲基亚砜、羟丙基‑β‑环糊精、6‑氧甲基喹啉、聚乙烯吡咯烷酮、吡啶、氢氧化钠、乙二胺四乙酸钠、乙醇组成。A液与B液均由磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠缓冲液配制。A液和B液按体积比1:1混合而成，经过滤获得均一稳定的单一组分FH显色液。本发明为特殊单项FH显色试剂具有灵敏度高、特异性强、微量检测、便捷快速的特点，是国内唯一的常温下保存18个月的单项上皮组织肿瘤细胞游离血红素显色试剂，检测线性范围为6.1～150μg/L,最低检测限为6.1μg/L。

技术领域

本发明涉及生物体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法。

背景技术

抑癌基因P53发生突变或缺失的肿瘤细胞中，在线粒体上“瓦博格效应”产生大量还原性辅酶Ⅱ(NADPH)，NADPH作为谷胱甘肽还原酶的辅酶，它可以使氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成为还原型谷胱甘肽(GSH),GSH作为供氢体在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)催化下分解H2O2，再生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，同时发生芬顿反应(Fenton)产生以羟自由基为主活性氧族(reactive oxygen species,ROS)，使线粒体处的血红素蛋白(HP)受到攻击，HP蛋白亚基之间的作用力减弱，离子键、氢键、疏水键断裂，使多肽链的β折叠伸展、断裂，血红素口袋被打开，使那些原来包藏在蛋白疏水核内部的HP蛋白的活性基——血红素释放，成为游离血红素。游离血红素或亚铁血红素(free ferrous protopor-phyrin,FH)是上皮组织肿瘤在病理过程的“超早期“阶段，由其细胞内线粒体基膜上所产生的特异性肿瘤生物标志因子(Tumor Biomarker)，可因上皮肿瘤细胞性炎症渗出至上皮细胞性管腔的组织渗液(直肠渗液、宫颈渗液)中。上皮组织渗液包含脱落上皮细胞(正常细胞与肿瘤细胞)、游离血红素(FH)、活性氧族(ROS)等成分。因此，通过生理腔隙与管道(如肛管、直肠、阴道、宫颈管)，采用一次性无菌组织渗液拭子或组织细胞收集刷，即可实现对上皮细胞及渗液样本的有效采集，并满足FH微量检测对所需样本采集的要求。正常上皮细胞内及渗液中上皮细胞内游离血红素含量极低。当上皮细胞稳定性发生“超早期”恶性变化时，而其细胞学形态特征尚未出现明显异常改变之前，上皮细胞内游离血红素含量会明显增加，且与上皮细胞稳定性恶性变化程度呈正相关。因此，通过对上皮细胞内游离血红素(FH)检测即可克服目前基于细胞形态学检测技术，如巴氏涂片法、薄层液基细胞学检测技术(TCT)等容易发生早期筛查漏诊及误诊的“痛点”，实现对上皮细胞恶性肿瘤及癌前病变的超早期筛查。故检测上皮细胞内游离血红素含量可作为评估上皮细胞稳定性早期恶性变化(恶性肿瘤)风险程度的重要依据。目前虽有同类组织细胞渗液单组份游离血红素(FH)检测显色液报道，但仍存在诸多难以克服质量技术与临床应用的局限性：(1)由于缺乏亚铁血红素检测线性范围、最低检测限等关键定量检测技术指标，因此，属于简单的、灵敏度较低的“定性检测”技术；(2)传统FH显色液配方中不含有络合剂成分，其特征吸收峰值及波长数据不明确，因此其检测特异性与灵敏性均受质疑；(3)由于配方中存在稳定性与氧化性成分配比、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶解性与稳定性难题，导致FH显色液难以实现常温下长期保存。鉴于上述诸多配方与技术缺陷原因，传统单一组份FH显色液的检测灵敏度、准确性、稳定性均存在明显“致命”缺陷，因此目前上皮组织细胞单组份游离血红素检测技术在临床上指导恶性肿瘤早期筛查的价值是极为有限。

检测原理：

检测上皮组织肿瘤细胞内及渗液中游离血红素原理是利用亚铁原扑啉具有类似过氧化物酶催化活性。在有供氧体(H₂O₂)和供氢体(TMB)存在的情况下，血红素摘取H₂O₂的氧原子使之还原，本身与摘取的氧原子结合形成氧化型血红素；氧化型血红素极不稳定，迅即又脱掉氧原子传递给TMB，使原本不含发色基团的供氢体(TMB)氧化生成含发色基团-醌基的蓝色物质。

氧化还原反应原理如下：