[发明专利]一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法

说明书

本申请公开了一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法，该方法包括：选择功能缺失产生抗性的广谱抗性基因Pi21和Pid3；选择基因Pi21和Pid3的基因编辑位点，并扩增抗病基因的U3或U6 RNA启动子，构建CRISPR/Cas9载体；将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织，通过抗性筛选和分化培养得到T0代转基因植株；检测所述T0代转基因植株的检测子代植株是否含有Cas9外源DNA；筛选功能基因敲除的突变株系，并且扩增突变株系的靶位点DNA，TA克隆测序得到DNA突变信息；在后代中筛选不含Cas9外源DNA的，并且抗病基因Pi21或Pid3发生纯合突变的改良株系。通过本申请解决相关技术中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的新品种仍然会受到稻瘟病的侵害的问题，提高了水稻对稻瘟病的抗病性。

技术领域

本申请涉及属于结合基因工程技术的水稻品种改良领域，具体而言，涉及一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法。

背景技术

近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术发展较为迅速。CRISPR/Cas9系统已经逐渐发展为遗传育种中改良作物的有效手段，可针对某些有优质稻却存在不良性状的材料进行基因位点编辑，从而获得兼并优良品质与性状的新品种。

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一。但其产量每年都会受制于稻瘟病的暴发，被稻瘟病侵染一般会造成10％-20％的减产，发病严重时可达到40％-50％，有的地区甚至绝产。稻瘟病的危害不仅表现在严重的产量损失，也会严重影响稻米品质。常规育种主要是依靠抗性表型来进行选择，但高度依赖水稻品种、致病小种等因素，选育效率不高，且耗时长。因此，提高稻瘟病抗性，对提高水稻产量仍然有着重要意义。

稻瘟病是由稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的病害，在水稻整个生育期中都可发生。目前，除了第3号染色体没有发现抗性基因之外，其余染色体上都有抗性基因分布，现已有二十多个稻瘟病抗性基因得到克隆且进行功能验证(易怒安,李魏,戴良英.水稻抗稻瘟病基因的克隆及其分子育种研究进展[J].分子植物育种,2015,13(07):1653-1659)。Pid3基因是Shang等(Shang J J,Tao Y,Chen X,et al.Identification of a newrice blast resistance gene,Pid3,by genomewide comparison of pairednucleotide-binding site--leucine-rich repeat genes and their pseudogenealleles between the two sequenced rice genomes.Genetics.2009Aug；182(4):1303-11)通过设计特异于日本晴NBS-LRR假基因等位基因的PCR分子标记，比较籼稻和粳稻假基因化差异，从籼稻品种‘地谷’中鉴定出来的一个主效稻瘟病抗性基因。

之后Chen等(Chen J,Shi Y,Liu W,et al.A Pid3 allele from rice cultivarGumei2 confers resistance to Magnaporthe oryzae.J Genet Genomics.2011May20；38(5):209-16)从籼稻品种‘谷梅2号’中利用图位克隆方法分离出一个新的稻瘟病抗性等位基因Pi25，分析表明与Pid3蛋白序列完全一致。Pid3位于第六号染色体上，其cDNA全长为2970bp，包含两个外显子，编码923个氨基酸，含有NBS-LRR结构域和MHD基序的蛋白产物(赵文,王静,李伟滔,等.应用GST pull-down技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白PID3互作蛋白的研究[J].植物病理学报,2015,45(05):476-485)。

但是发明人发现，新品种仍然会受到稻瘟病的侵害，从而造成减产等问题。

发明内容

本申请提供一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法，以解决相关技术中新品种仍然会受到稻瘟病的侵害，从而造成减产等问题。