[发明专利]一种导致先天性耳聋的CRISPR/Cas9系统及其在制备模型猪核供体细胞中的应用在审
| 申请号： | 202011304451.6 | 申请日： | 2020-11-19 |
| 公开（公告）号： | CN112522264A | 公开（公告）日： | 2021-03-19 |
| 发明（设计）人： | 牛冬;汪滔;马翔;曾为俊;王磊;程锐;陶裴裴;赵泽英;刘璐;黄彩云 | 申请（专利权）人： | 南京启真基因工程有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/62;C12N15/12;C12N5/10 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人： | 傅婷婷;徐冬涛 |
| 地址： | 211306 江苏省南京市高淳区经*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 导致 先天性 耳聋 crispr cas9 系统 及其 制备 模型 供体 细胞 中的 应用 | ||
1.一种用于TMC1基因编辑的sgRNA靶点，其特征在于序列如SEQ ID NO：21所示。
2.一种用于TMC1基因编辑的gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO：25所示。
3.一种针对猪TMC1基因的gRNA表达载体，其特征在于以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG-U6gRNA为载体骨架，表达权利要求2所述的gRNA。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于将SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG-U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得。
5.一种用于猪TMC1基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和权利要求3或4所述的针对猪TMC1基因的gRNA表达载体。
6.根据权利要求5所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。
7.根据权利要求6所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。
8.权利要求5～7中任一项所述的CRISPR/Cas9系统在构建先天遗传性耳聋克隆猪核供体细胞中的应用。
9.一种重组猪成纤维细胞，其特征在于由权利要求5～7中任一项所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
10.权利要求9所述的重组细胞在构建TMC1基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建TMC1基因敲除的先天遗传性耳聋克隆猪中的应用。
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