[发明专利]一种转基因甘蔗事件SCAG5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法

说明书

本发明提供了一种转基因甘蔗事件SCAG5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法。所述的转基因甘蔗SCAG5的外源插入片段侧翼序列，其包含核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的左侧翼序列和/或核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的右侧翼序列。本发明还提供了转基因甘蔗SCAG5的品系特异性检测方法，该方法特异性好，灵敏度高，检出极限为100ng/ul DNA模板浓度的0.1％，相当于9个单倍体甘蔗基因组拷贝数，这一检测灵敏度远高于欧盟对转基因植物衍生的食品及饲料标识的0.9％的最低限量，为转基因甘蔗SCAG5的利用及产品检测身份识别提供了技术基础与依据。

技术领域

本发明涉及转基因甘蔗领域，具体涉及一种转基因甘蔗事件SCAG5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法。

背景技术

自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与产业应用快速发展。2018年全球26个国家种植了1.917亿公顷转基因作物，比2017年增长1％，2019年全球共有43项关于转基因作物的批准，有9个新的转基因作物品种获得批准，包括油菜，棉花、豇豆、大豆和甘蔗。而国内农业农村部也公示了192个拟颁发“农业转基因生物安全证书”的植物品种，其中包括189个棉花、2个玉米和1个大豆品种。由此可见转基因作物种植及应用在未来仍然持续保持稳定增长，转基因作物的安全性问题早已成为国际社会关注的热点，因此对转基因作物进行有效的评估与后续的监管是当前亟需的问题。

每一个转化事件中，携带外源基因的T-DNA在受体植物的插入都是随机的，尽管携带相同的外源基因，T-DNA左右两侧与受体植物基因组的连接区域的碱基序列仍然是不同的，因此T-DNA侧翼序列的克隆以及定位是明确转基因作物的分子特征的基础，对于转因植株的身份识别具有重要意义；另一方面T-DNA在受体基因组中的插入位点对外源基因的表达以及受体内源基因的表达均有可能产生互相影响，因此分析T-DNA的插入位点对于研究转基因植物的稳定遗传及表达有重要的意义。所以T-DNA插入位点信息，侧翼序列和拷贝数等转基因作物的分子特征是转基因生物安全评估和后续监测的基础，这些信息将有助于转基因植物的安全性做出充分评估。

目前获取T-DNA侧翼序列最常用的技术之一是染色体步移法(Genome Walking)，染色体步移法是以PCR技术为基础发展而来，大体上分为依赖酶切连接与不依赖酶切连接的两类。依赖酶切连接的染色体步移法(如反向PCR、载体PCR等)由于酶切位点分布随机造成连接效率偏低，从而引起PCR扩增效率下降，导致成功率降低。另一类不依赖酶切连接的染色体步移法(如快速通用的步移方法、高通量染色体步移等)操作简便，不受酶切位点影响的优点，虽然非特异扩增较多，但经过3-4轮的巢式PCR扩增，仍然可以获得满意的实验结果。利用此类技术已经成功分离了转基因水稻、玉米、棉花、小麦和马铃薯等T-DNA侧翼序列，并建立其相应的转化事件特异性检测技术；转基因作物转化事件特异性检测技术是以其转基因T-DNA侧翼序列的部分序列为靶标进行扩增，扩增产物是T-DNA 5’端或3’端序列与受体基因组的拼接序列，因此具有高度特异性，可准确识别不同的转基因作物品系。