[发明专利]一种手足口病CVA6的LAMP引物组筛选方法

说明书

一种手足口病CVA6的LAMP引物组筛选方法，涉及病毒检测技术领域，包括如下步骤：步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法的对照；步骤二：利用LAMP引物设计软件设计出多组手足口病CVA6的LAMP引物组；步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；步骤四：用多组手足口病CVA6的LAMP引物组对样本进行LAMP试验；步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测；步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物组，本发明通过手足口病CVA6的相关序列获得手足口病CVA6典型的LAMP扩增电泳条纹图案，为后续的手足口病CVA6的检测方法选出合适的引物组。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及到一种手足口病CVA6的LAMP引物组筛选方法。

背景技术

手足口病是一种以感染儿童和幼儿为主的出疹性传染病。以发热和手、足、口等部位岀现皮疹或疱疹为特征，少数患者出现严重并发症而死亡。

病原体为肠道病毒属、微小核糖核酸病毒科，种类高达20多种，引起手足口病的肠道病毒血清型分为肠道病毒71(EV71)、埃可病毒(ECHO)、柯萨奇病毒(CV)A组和B组等。文献报道同，近年来由柯萨奇病毒A6(CVA6)导致的手足口病在欧洲、北美和亚洲多个国家暴发流行，己快速上升为手足口病的主要致病原。临床症状显示，CVA6导致的手足口病患者表现为多部位的岀疹甚至脱甲，成人感染和重症病例也有较多报道。分子流行病学显示，近年来流行的CVA6为新型变异株与其他型别的肠道病毒存在重组，可能是导致临床症状改变的潜在原因。

2014-2018年，虹口区手足口病原监测了429例病例，病毒阳性232例，阳性率54.1％。其中CVA6型123例，占53.0％,为本区手足口病的主要病原体。

实验室诊断手足口病的方法主要包括病毒分离、血清学方法和分子生物学方法，其中病毒分离作为经典的方法一直被延续使用，但实验用时较长。由于肠道病毒型别多样，使用血清学方法鉴定的肠道病毒型别有限，且不同血清型的肠道病毒间存在交叉反应，可能造成结果假阳性。随着分子生物学的迅速发展，基因序列分型发现了多种新型肠道病毒。

由于CVA6在手足口病患者中的阳性率快速上升，研究者们开始设计特异性检测CVA6的分子生物学方法，可在短时间内快速筛查大量临床标本。例如，在新加坡手足口病暴发期间，研究者设计了针对CVA6VP1蛋白3,端的特异性引物来检测CVA6；近年来中国台湾地区流行的CVA6和CVA6原型株在基因序列上存在较大差异，因此中国台湾研究者设计多组引物，通过基于聚合酶链反应的引物步移技术，获取了部分中国台湾地区CVA6的全长序列。另外，Zhang等以VP1作为目标片段，设计了对CVA6进行快速定量检测的引物和探针，灵敏度达每毫升10病毒拷贝，且特异性良好。

手足口病的确诊需要依靠PCR的方法检测病毒核酸，但由于基层医院设备及技术的限制，PCR法操作较为复杂，需要专业PCR仪器，且耗时较长，难以推广。

又由于PCR方法的高敏感性和特异性，在提取、扩增核酸过程中，核酸产物易污染实验室中的试剂、仪器设备和通风系统，从而造成实验室污染，出现假阳性结果。

环介导等温基因扩增技术(loop-mediated isothermalamplification,LAMP),是由Notomi等在2000年发明的基因扩增方法，该法检测耗时短、灵敏度高、成本低廉，而且在整个反应过程及后续的结果观察中不需要特殊的仪器设备，适用于基层早期对流感病毒的检测和诊断。是一种简单快速的核酸扩增技术。

另有文献报道，LAMP检测CVA16的灵敏性比传统的PCR检测方法高100倍，LAMP检测CVA16的检出率与PCR相当，通过两种方法的比较，可知LAMP比PCR更快速，灵敏，有着更为广泛的发展前景。