[发明专利]一种用于生产叶黄素的重组酵母及其应用

说明书

本发明公开了一种用于生产叶黄素的重组酵母，在酵母中外源导入八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε‑环化酶基因、番茄红素β‑环化酶基因、胡萝卜素β‑羟化酶基因和胡萝卜素ε‑羟化酶基因。本发明通过基因克隆和密码子优化，获得六个可以在酵母中成功表达的酶，构建得到生产叶黄素的基因工程酵母菌株。在八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε‑环化酶的催化下生产δ‑胡萝卜素，然后在番茄红素β‑环化酶、胡萝卜素β‑羟化酶、胡萝卜素ε‑羟化酶的催化下将δ‑胡萝卜素转化成叶黄素。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于生产叶黄素的重组酵母及其应用。

背景技术

叶黄素(Lutein)化学名为3,3’-二醇-α-胡萝卜素，能在高等植物和藻类中合成，并且在生理代谢中起着重要作用。作为植物光系统的重要组成部分，叶黄素在光合作用中捕获光能，调节植物生长和发育，并以生物信号分子参与植物与环境的相互作用。叶黄素也是视网膜黄斑色素的重要成分，具有吸收蓝光保护眼睛的功能，由于人类自身无法生成叶黄素，所以需要从食物中摄取。研究表明叶黄素可以预防和治疗视网膜损伤，包括年龄相关性黄斑变性、青光眼和糖尿病视网膜病变。叶黄素作为营养保健品，可以改善心血管疾病、动脉粥样硬化和癌症。除了在医疗保健行业的应用，叶黄素还广泛应用于水产养殖、家禽养殖和化妆品。

目前，市场上的叶黄素主要从万寿菊花瓣提取而来，大多数以叶黄素酯的形式存在，但其天然含量低，且植物种植具有季节性、地域限制性、耗费劳动力等缺点。藻类作为自然界叶黄素含量较高的微生物已作为替代来源，目前相关文献主要研究培养基组成、光照强度、盐度和温度对叶黄素积累的影响。虽然通过控制环境参数成功地提高了叶黄素的产量，但藻类的固有生理特性和遗传途径有待进一步研究。同时，培养条件苛刻、提取困难等问题使得利用藻类大面积生产叶黄素也极具挑战性。本发明提供了一种以安全、高效的酵母为细胞工厂异源合成叶黄素的方法，为工业生产叶黄素提供新的思路和方法。

叶黄素的生物合成存在一个关键中间代谢物竞争性利用的问题：中间代谢物番茄红素既可以通过番茄红素ε-环化酶和番茄红素β-环化酶的连续催化形成α-胡萝卜素；又可以直接在番茄红素β-环化酶的两步催化下形成β-胡萝卜素(图1)。在前期研究中，我们发现两种番茄红素环化酶对于番茄红素的催化活性差异很大，在两者共同表达的情况下，副产物β-胡萝卜素大量产生而目标产物α-胡萝卜素几乎不能合成。

植物中大多数的萜烯合成酶在转运肽的引导下以质体作为定位靶点，由于酵母无法水解质体转运肽，所以在合成异植物源基因时会直接切除其转运肽序列，在酵母中异源表达后蛋白会游离于细胞质中。对于堆积在细胞膜上的底物如类胡萝卜素，游离的蛋白与底物接触的机会较少，从而限制了底物的转化效率和产物的合成。

发明内容

本发明提供了一种反应顺序可控的生物合成途径构建方法。该顺序调控系统为生物合成的分步骤精细调控奠定了理论和方法基础。

本发明提供了一种将细胞膜定位序列与关键酶融合表达用于有效地进行叶黄素生物合成，提高番茄红素转化效率的应用。

一种用于生产叶黄素的重组酵母，在酵母中外源导入八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε-环化酶基因、番茄红素β-环化酶基因、胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因。在八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶的催化下生产δ-胡萝卜素，然后在番茄红素β-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶的催化下将δ-胡萝卜素转化成叶黄素。

优选的，八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε-环化酶基因、番茄红素β-环化酶基因、胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因的基因序列分别如SEQ ID No.1～6所示。