[发明专利]用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒

权利要求书

1.用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒，其特征在于，该表达质粒命名为shPD-L1，具体通过如下步骤构建获得：

（一）设计引物

设计上下游引物如下：

PD-L1引物上游：5’- GCCGAAATGATACACAATTCGA-3’，

PD-L1引物下游：5’- CCGAAATGATACACAATTCGA-3’；

（二）提取RNA提取，并反转录成cDNA备用

以B16-OVA细胞基因组为提取对象，提取其总RNA，并反转录为cDNA备用；

（三）PCR扩增

以步骤（二）中的cDNA为模板，利用步骤（一）中所设计引物进行PCR扩增，并回收目的DNA片段；

（四）酶切，并与pSicoR-GFP vector连接

利用HpaI、XhoI酶分别对步骤（三）所回收目的DNA片段与pSicoR-GFP vector进行双酶切；酶切后分别回收酶切产物，并利用T4 DNA连接酶进行连接；

（五）转化、筛选和鉴定

采用热激转化法，将步骤（四）中连接产物转化，并进行筛选，检测和鉴定，确保质粒连接重组正确，并将重组正确的质粒命名为：shPD-L1。

2.利用权利要求1所述RNAi表达质粒所制备的纳米载体，其特征在于，该纳米载体命名为：CCM/MSN@shPD-L1纳米载体，制备时，通过静电吸附方式，将质粒shPD-L1负载到电位为正电荷的MSN-NH₂的介孔后，在MSN表面再包覆CCM，具体通过如下步骤制备获得：

（一）制备MSN@shPD-L1纳米复合物

将MSN和质粒shPD-L1进行混合，以使质粒shPD-L1负载到MSN上，以制备获得MSN@shPD-L1纳米复合物；

以质量比计，MSN：shPD-L1=10~40:1；

（二）提取细胞膜，并制备细胞膜囊泡

取培养好的细胞，匀浆裂解处理后，收集细胞膜；利用挤出机，挤压细胞膜悬液，获得细胞膜囊泡；

（三）制备CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物

首先，将步骤（一）中所制备的MSN@shPD-L1纳米复合物与步骤（二）所制备细胞膜囊泡混合均匀；

随后，利用挤出机挤压混合液，以产生细胞膜包裹的纳米粒子，最终所得即为CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物。

3.如权利要求2所述纳米载体，其特征在于，步骤（一）中，以质量比计，MSN：shPD-L1=30:1。

4.权利要求1所述RNAi表达质粒或权利要求2所述纳米载体在制备抗肿瘤药剂中的应用。

5.如权利要求4所述在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。

6.权利要求2所述纳米载体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（一）制备MSN@shPD-L1纳米复合物

首先，采用无菌水对介孔二氧化硅纳米颗粒进行清洗；

随后，将清洗后的MSN纳米粒和质粒shPD-L1在缓冲液中进行混合，以进行静电吸附；

最后，离心、收集所得沉淀即为MSN@shPD-L1纳米复合物；

（二）提取细胞膜，并制备细胞膜囊泡

首先，培养细胞，并选取生长状态良好的细胞用缓冲液清洗一遍，收集细胞备用；

随后，对所收集的细胞进行匀浆裂解；

再后，将破碎后的细胞转移到离心管中，离心收集上清液；

最后，在上清液中加入膜提取剂，收取细胞膜碎片；

制备细胞膜囊泡时，在上述所提取的细胞膜碎片沉淀物中加入缓冲液重悬；再用挤出机挤压细胞膜悬液，获得细胞膜囊泡；

（三）制备CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物

首先，将步骤（一）中所制备的MSN@shPD-L1纳米复合物与步骤（二）所制备细胞膜囊泡混合均匀；

随后，用挤出机挤压混合液，以产生细胞膜包裹的纳米粒子，最终所得即为CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物。