[发明专利]识别Caspase蛋白的自组装多肽探针、制备方法及应用

权利要求书

1.识别Caspase蛋白的自组装多肽探针，其特征在于，Caspase蛋白为Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白；

用于识别Caspase-3蛋白的自组装多肽探针Nap-GFF_PYDEVD-AFC的结构式如下：

用于识别Caspase-8蛋白的自组装多肽探针Nap-GFF_PYIETD-AFC的结构式如下：

其中，-Nap＝

2.权利要求1所述的识别Caspase蛋白的自组装多肽探针的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)中间体化合物Fmoc-Asp(OH)-AFC的合成过程如下：

i)取Fmoc-Asp(OtBu)-COOH、香豆素151，加入无水吡啶，在负15摄氏度条件下滴加三氯氧磷进行反应；反应后加入盐酸溶液，萃取、干燥后得到Fmoc-Asp(OTBu)-AFC；

ii)把Fmoc-Asp(OtBu)-AFC溶于三氟乙酸溶液中，冰浴条件下反应，得到Fmoc-Asp(OH)-AFC；

(2)Nap-GFF_PYDEVD-AFC和Nap-GFF_PYIETD-AFC的合成过程如下：

iii)在固相合成器中将(1)中合成的Fmoc-Asp(OH)-AFC连接在固相载体2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂，反应1-3小时；

iv)用哌啶的二甲基甲酰胺溶液去除保护基团Fmoc，取多肽缩合剂HBTU放入iii)步骤的固相合成器中，依次加入Fmoc-缬氨酸、Fmoc-谷氨酸，Fmoc-天冬氨酸、Fmoc-磷酸酪氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Fmoc-甘氨酸进行反应，并用萘乙酸对多肽的N端进行封端，即可得到Nap-GFFPYDEVD-AFC；依次加入Fmoc-苏氨酸、Fmoc-谷氨酸、Fmoc-异亮氨酸、Fmoc-磷酸酪氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Fmoc-甘氨酸，并用萘乙酸对多肽的N端进行封端，即可得到Nap-GFFPYIETD-AFC；

v)用三氟乙酸把制备的短肽从树脂上切除，并将所得Nap-GFF_PYDEVD-AFC和Nap-GFF_PYIETD-AFC分别进行分离。

3.权利要求1所述的识别Caspase蛋白的自组装多肽探针在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用，其特征在于，Nap-GFF_PYDEVD-AFC小分子化合物在细胞膜表面碱性磷酸酶的作用下，自组装形成纳米纤维，并以内吞的方式进入细胞；被凋亡细胞中Caspase-3蛋白识别，并切割释放出荧光基团AFC，起到在活细胞中实时检测Caspase-3蛋白表达的作用。

4.权利要求1所述的识别Caspase蛋白的自组装多肽探针在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用，其特征在于，Nap-GFF_PYIETD-AFC小分子化合物在细胞膜表面碱性磷酸酶的作用下，自组装形成纳米纤维，并以内吞的方式进入细胞；被凋亡细胞中Caspase-8蛋白识别，并切割释放出荧光基团AFC，起到在活细胞中实时检测Caspase-8蛋白表达的作用。