[发明专利]一种鲍曼不动杆菌的绿色荧光蛋白基因标记方法

权利要求书

1.一种鲍曼不动杆菌的绿色荧光蛋白基因标记方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)构建pET-RA-Y大肠杆菌-鲍曼不动杆菌穿梭质粒：以Genebank上NO.HM219006.1的pET-RA序列为基础序列模板，采用基因合成法构建质粒pET-RA-Y。

(2)制备鲍曼不动杆菌感受态细胞：将pET-RA-Y大肠杆菌-鲍曼不动杆菌穿梭质粒导入到保藏号为ATCC17978的鲍曼动杆菌标准菌株中，并进行鉴定，导入成功的菌株标记为Ab-GFP菌株；

(3)荧光菌株观察：将Ab-GFP菌株行LB肉汤扩增培养，至肉眼可见明显浑浊时荧光显微镜观察菌株是否携带荧光；

(4)荧光标记鲍曼不动杆菌的稳定性与可靠性检测：

(a)选择人肺泡上皮细胞作为宿主细胞。

(b)荧光标记菌株与人肺泡上皮细胞共培养。

(c)采用细胞荧光染色法，利用共聚焦荧光显微镜观察细菌感染细胞的模型，包括荧光标记鲍曼不动杆菌在细胞内外的荧光强度、荧光保持时间，并验证导入荧光质粒后对其感染细胞力的影响。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的pET-RA-Y序列如SEQ IDNO.1所示，pET-RA-Y序列包含SEQ ID NO.2的启动子序列、SEQ ID NO.3的GFP序列、SEQ IDNO.4的利福平抗性筛选标记序列、SEQ ID NO.5的鲍曼不动杆菌基因复制起始点序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体取pET-RA-Y加入含E.coliDH5α感受态细胞中，构建pET-RA-Y大肠杆菌，另制备鲍曼动杆菌标准菌株感受态细胞，将pET-RA-Y大肠杆菌与其共培养，用pET-RA-Y-F/pET-RA-Y-R引物进行PCR，同时用菌株直接测序，检验pET-RA-Y是否成功导入鲍曼动杆菌标准菌株中。