[发明专利]一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法

说明书

本发明属于医学生物技术研究领域，本发明公开一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，步骤包括：1、设计crRNA序列并通过体外转录合成；2、使用NCBI Primer Blast在线工具设计HBV基因组DNA的通用型重组聚合酶扩增(RPA)引物；3、合成与纯化乙型肝炎病毒RNA；4、使用Cas13a酶和能够同时识别HBV B型和C型病毒的HBV crRNA进行检测方法的灵敏度测试；5、使用Cas13a酶和crRNA对含有HBV B型或C型基因组DNA的质粒进行酶切荧光测试。与目前常规的检测手段相比，本发明公开的方案具有操作简单，灵敏度高，价格低的特点，同时在其特异性识别区域含有额外的发卡结构，以提高检测高特异性，可以在1‑2小时内实现对HBV基因型的区分。

技术领域

本发明属于医学生物技术研究领域，涉及一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)仍是世界范围内的一个公共卫生问题，超过3.5亿感染者可能罹患终末期肝病和肝细胞癌(HCC)。中国是乙型肝炎高流行地区，因为超过 8％的人口报告有慢性HBV感染。HBV可分为10个基因型，标记为A到J，在核苷酸序列上分布明显。基因型B和C主要分布在大洋洲和亚洲，包括中国，而基因型A和D分布在非洲和欧洲。研究证据表明，了解基因型对疾病进展和确定有效的抗病毒治疗有重要意义。例如，B型和C型感染的慢性发生率低于A型和D 型。基因型被认为与围产期感染和不良预后关系更密切，而B型则表现出更好的治疗效果。总之，乙型肝炎病毒基因分型可能对临床结果和抗病毒治疗有显著影响。

成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR-相关的(Cas)核酸酶系统在分子诊断中的应用已引起广泛关注。Cas13a酶是一种由CRISPR RNA(crRNA) 引导的RNA核酸内切酶，可在crRNA的指引下和靶标RNA特异性结合并激活核酸酶活性，是一种很有前景的RNA传感平台工具。由于CRISPR-Cas系统对多种核酸靶标具有较高的特异性，已经有研究证明了单核苷酸变异(SNVs)/单核苷酸多态性(SNPs)检测的可行性。这些特性表明CRISPR-Cas系统可以作为一个基因分型平台。

目前，用于HBV基因型的诊断通常分为以下几种方法，包括基因型特异性 PCR，线性探针检测，限制性片段长度多态性(RFLP)，实时PCR，反向杂交，直接测序和荧光偏振测定等。但是使用线性探针法检测HBV基因型的稳定性较差，仅靠碱基互补配对原则对不同基因型进行区分，检测结果容易受到客观因素如反应缓冲液、pH值等干扰，且检测灵敏度较低，对于少量样本进行检测时，难度较大，不太适用于临床快速检测的需求。PCR技术的HBV基因分型方法虽然具有灵敏度高的优势，但是需要专门的热循环仪和相关技术人员操作，且相关探针设计比较复杂，不太适用于技术贫乏地区的现场快速检测需求。限制性片段长度多态性(RFLP)方法成本较低，原理简单，但是灵敏度较差，且操作过程繁琐，使其临床应用受到较大的限制。利用HBV基因组DNA直接测序的方法进行分型检测的成本较高，不适用于发展中国家患者的就诊需求，且技术要求太高，不适用于大多数检测场景。

因此，开发一种灵敏，快速，低成本，易于使用且高特异性的方法用于乙型肝炎病毒基因分型的临床诊断至关重要。所以本领域技术人员致力于研发一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法。

发明内容

为了提供一种灵敏，快速，低成本，易于使用且高特异性的方法用于乙型肝炎病毒基因分型的检测手段，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型检测方法，该方法包括以下步骤：

1、设计crRNA序列并通过体外转录合成；

2、使用NCBI Primer Blast在线工具设计HBV基因组DNA的通用型重组聚合酶扩增(RPA)引物；

3、合成与纯化乙型肝炎病毒RNA；