[发明专利]一种高活力羰基还原酶突变体及其应用

说明书

本发明揭示了一种高活力羰基还原酶突变体及其应用，其氨基酸序列如SEQ DI NO:1所示。本发明通过高通量筛选获得含Tyr40Ser和Gly176Lys两个氨基酸突变的高转化活力的Ss‑mArase突变体，用于还原4‑氯乙酰乙酸乙酯成(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯中，该酶转化活力相对于野生型提高了52%以上。

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种高活力羰基还原酶突变体及其应用。

背景技术

4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）可被羰基还原酶（aldehyde reductase， ARase）还原成4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE）。CHBE是一种重要的有机合成中间体，其中(R)- CHBE可用于合成L-肉碱，又称为“左旋肉碱”，是一种类维生素营养素，另外还是脂肪代谢过程中一种关键物质，能促进脂肪酸进入线粒体进行氧化分解，有利于促进脂肪代谢平衡。由于左旋肉碱在机体内运送长链脂肪穿过细胞膜入线粒体氧化分解以供给机体能量的载体，从而分解代谢脂肪，因而在应用于制造减肥降脂产品方面具有极大的市场。

CHBE理论上可以由手性源法、外消旋体拆分法和不对称合成法三种合成方法获得，但由于手性源法和外消旋体拆分法本身固有的缺点，因此利用不对称合成法合成光学活性CHBE的主要方法为化学催化合成法和生物催化法。化学法具有原料易得，操作简单，条件温和是的优点，但这种方法属于非均相催化合成反应，导致对映体选择性较低；另外化学方法还有较强毒性，工艺条件不宜控制的缺点。生物催化法制备手性化合物具有反应条件温和，高效率，环境友好和较高选择性的特点而逐渐被人们接受。

许多微生物都能还原COBE，但绝大多数微生物的还原产物是S构型，只有少数微生物能获得R型还原产物，如赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、卡斯太拉德巴利酵母(Debaryomyces castellii)及掷孢圆酵母(Torulaspora nagoyaensis)等，但产物的手性选择性即对映体过量(ee)值只有8%～63%。造成ee值低的主要原因是这些微生物中的酶系复杂，既有合成R型也有合成S型CHBE的能力，同时酶的转化活力也较低。为了提高生物催化反应的对映体选择性、产率和转化率，即需研究一种新的方法。

发明内容

鉴于现有技术存在上述缺陷，本发明的目的在于提供一种通过突变筛选用于还原4-氯乙酰乙酸乙酯酶的高活力羰基还原酶，用于提高生物催化反应的对映体选择性、产率和转化率。

本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：

一种高活力羰基还原酶突变体Ss-mArase，其氨基酸序列如SEQ DI NO:1所示。

SEQ ID NO:1如下所示：

MVGTTTLNTGASLELVGYGTWQAAPGEVGQGVKVAIETGSRHLDLAKVYSNQPEVGAAIKEAGVKREDLFITSKLWNNSHRPEQVEPALDDTLKELGLEYLDLYLIHWPVAFPPEGDITQNLFPKANDKEVKLDLEVSLVDTWKAMVKLLDTGKVKAIGVSNFDAKMVDAIIEATKVTPSVNQIERHPLLLQPELIAHHKAKNIHITAYSPLGNNTVGAPLLVQHPEIKRIAEKNGCTPAQVLIAWAIVGGHSVIPKSVTPSRIGENFKQVSLSQEDVDAVSKLGEGSGRRRYNIPCTYSPKWDINVFGEEDEKSCKNAVKIK

优选地，一种编码如以上所述的高活力羰基还原酶突变体Ss-mArase的突变体的基因，所述基因核苷酸序列如SEQ DI NO:2所示。

SEQ ID NO:2序列如下所示：