[发明专利]提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用

说明书

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对信号肽M1(MSDEQKKPE QIHRRDILKWGAMAGAAVA)的N端区域进行定向进化，筛选获得具有高效胞外分泌水平的信号肽突变体文库，通过该突变体文库构建获得系列重组蛋白胞外分泌水平显著提高的重组枯草芽孢杆菌菌株。将获得的正向信号肽突变体进行排列组合复合突变，获得具有高效重组蛋白表达分泌水平的信号肽复合突变体，利用其构建获得具有高效胞外蛋白胞外分泌水平的枯草杆菌杆菌突变株。本发明所筛选获得的信号肽突变体，对于重组蛋白在枯草芽孢杆菌中具有高效的胞外蛋白分泌水平，重组蛋白胞外分泌水平提高了15倍以上。本发明方法对信号肽改造及重组蛋白在宿主中的高效分泌与生产具有重要指导意义。

技术领域

本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧产孢的革兰氏阳性菌株，细胞壁结构简单，仅含单层细胞膜，具有高效的蛋白分泌能力，常被用作生产淀粉酶、蛋白酶等工业酶制剂的理想表达宿主。信号肽(Signal Peptide，简称SP)是一段引导新合成蛋白质跨膜转移的N端氨基酸序列，长度约15～30个氨基酸残基。不同来源的信号肽虽无明显的同源性，但均由三部分组成，包括碱性氨基酸组成的N端、疏水性氨基酸组成的H区和亲水氨基酸组成的C端。带正电荷的N端，负责引导新合成的多肽链结合到带负电荷的内质网膜上；H区是信号肽的主要功能区，介导蛋白质的跨膜转运；C端提供信号肽酶(SPase)识别位点。

在枯草芽孢杆菌表达系统中，信号肽与外源基因的匹配度是影响外源蛋白分泌的重要因素之一，不同信号肽对同一外源基因的分泌表达影响不同，相同信号肽对不同外源基因的分泌表达影响也不同。因此，针对某一特定基因，筛选合适的信号肽对于实现该基因的高效表达具有重要意义。Degerin等构建了含173种枯草芽孢杆菌信号肽和220种B.licheniformis的信号肽，分别与来源于B.amyloliquefaciens的枯草菌素基因进行融合表达，最终筛选到两个最适枯草菌素分泌表达的信号肽，在这两个信号肽的引导下，其产量较野生型信号肽提高7倍。但目前已报道的信号肽及改造信号肽的方法，主要集中在信号肽的筛选及信号肽的理性设计，该方法存在一定的局限性，仍不能满足重组蛋白在枯草芽孢杆菌表达宿主的高效分泌表达，特别是普适性的高效分泌表达。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过对信号肽M1(MSDEQKKPEQIHRRDILKWGAMAGAAVA，SEQ ID NO.1)的N端区域进行定向进化，筛选获得具有高效胞外分泌水平的信号肽突变体文库，通过该突变体文库构建获得系列重组蛋白胞外分泌水平显著提高的重组枯草芽孢杆菌菌株。将获得的正向信号肽突变体进行排列组合复合突变，获得具有高效重组蛋白表达分泌水平的信号肽复合突变体，利用其构建获得具有高效胞外蛋白胞外分泌水平的枯草杆菌杆菌突变株。本发明方法对信号肽改造及重组蛋白在宿主中的高效分泌与生产具有重要指导意义。

本发明的第一个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体，所述的信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10所示。

进一步地，所述的重组蛋白为淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、磷脂酶、胶原蛋白、蛛丝蛋白、甲基对硫磷水解酶、纳豆激酶中的一种或多种。

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌WB600或枯草芽孢杆菌WB800。

进一步地，所述的重组蛋白通过质粒pMA5、pMA0911或pWB980进行表达。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的信号肽突变体的基因。