[发明专利]滑膜肉瘤类器官的培养方法和培养基以及移植体及其用途

权利要求书

1.一种培养滑膜肉瘤类器官的方法，其特征在于，该方法包括：

依次利用分离培养基和扩增培养基对滑膜肉瘤组织细胞进行分离、扩增培养，得到扩增培养产物；其中，所述分离培养基中含有丙戊酸，以所述分离培养基为基准，所述丙戊酸的浓度为2～3mmol/l；所述扩增培养基中含有丙戊酸，以所述扩增培养基为基准，所述丙戊酸的浓度为0.5～1.5mmol/l；

对所述扩增培养产物进行分离处理，得到细胞沉淀；

利用所述扩增培养基对所述细胞沉淀进行传代培养，得到传代培养产物；

获取所述传代培养产物中的固体部分，得到滑膜肉瘤类器官；

所述分离培养基中还含有5～20体积%的FBS、50～200U/ml的青霉素 G、50～200mg/ml的链霉素，1～10体积%的B27、1～10mM的烟酰胺、1～20µM的Y-27632、10～50μM的EGF、10～50μM的bFGF和余量的Leibovitz’s L-15培养基；

所述扩增培养基中还含有5～20体积%的FBS、50～200U/ml的青霉素 G、50～200mg/ml的链霉素，1～10体积%的B27、1～10mM的烟酰胺、10～50μM的EGF、10～50μM的bFGF和余量的Leibovitz’s L-15培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述依次利用分离培养基和扩增培养基对滑膜肉瘤组织细胞进行分离、扩增培养，得到扩增培养产物，包括：

将所述滑膜肉瘤组织细胞与所述分离培养基和基质胶混合，得到原代培养物，其中，所述原代培养物中，所述滑膜肉瘤组织细胞的浓度为1×10⁴～5×10⁴个/mL，所述基质胶的含量为分离培养基总体积的5～20%；

对所述原代培养物进行培养24～48h后，将所述扩增培养基补加至所述原代培养物的培养体系中，所述扩增培养基的补加量为所述原代培养物的培养体系的25～50体积%，继续培养所述原代培养物，直至其中60～80%细胞团的直径达到0.1～0.3mm，得到所述扩增培养产物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用所述扩增培养基对所述细胞沉淀进行传代培养，得到传代培养产物，包括：

将所述细胞沉淀与所述扩增培养基和基质胶混合，得到传代培养物，其中，所述传代培养物中，所述细胞沉淀的浓度为1×10³～5×10³个/mL，所述基质胶的含量为扩增培养基总体积的2～10%；

对所述传代培养物进行传代扩增培养，得到所述传代培养产物，其中，在所述传代扩增培养过程中，每隔2～3天，向培养体系中添加培养体系总体积的10-20%的所述扩增培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滑膜肉瘤组织细胞由滑膜肉瘤组织经酶解处理得到，其中，所述滑膜肉瘤组织保存于滑膜肉瘤保护液中，所述滑膜肉瘤保护液中含有两性霉素 B、青链霉素和Leibovitz’s L-15培养基，以所述滑膜肉瘤保护液为基准，所述两性霉素 B的用量为5～20μg/ml，所述青链霉素的用量为80～200μg/ml，余量为所述Leibovitz’s L-15培养基；

所述酶解处理包括：

将所述滑膜肉瘤组织与酶解液混合，得到待酶解物，其中，所述酶解液中含有FBS、分散酶、DNAse、Ⅰ型胶原酶、青链霉素和DMEM培养基，以所述酶解液为基准，所述FBS的含量为1～10体积%，所述分散酶的含量为0.1～1体积%，所述DNAse的含量为0.01～1体积%，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为0.5～10mg/ml，所述青链霉素的含量为1～5体积%，余量为所述DMEM培养基；

将所述待酶解物进行培养酶解0.5～2h，得到酶解产物；

对所述酶解产物进行分离处理，得到所述滑膜肉瘤组织细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以所述分离培养基为基准，所述丙戊酸的浓度为2.4～2.8mmol/l；

以所述扩增培养基为基准，所述丙戊酸的浓度为0.8～1.2mmol/l。