[发明专利]一种制备使心功能降低的突变型CNPase斑马鱼模型及应用的方法

说明书

本发明涉及到了CNPase突变型斑马鱼的制备，并通过确认了该突变体模型可自发严重心衰伴随的心率过缓乃心力衰竭。本发明采用CRISPR‑Cas9技术结合显微注射技术，特异性敲除CNPase，制备CNPase突变型F1代，并通过桑格测序的方法进行确认；通过杂交以及筛选，制备出心脏特异性标记绿色荧光的斑马鱼纯合突变品系，通过心脏病理学以及动力学指标，确认了CNPase纯合突变型斑马鱼可自发心肌肥大，部分发展至心力衰竭。本发明制备了CNPase突变型斑马鱼，为了研究CNPase的功能提供了动物模型，特别是为严重心衰伴随的心律过缓相关疾病的研究提供了极大的便利。

背景技术

2’,3’-环核苷酸-3’-磷酸二酯酶(2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase， CNPase)，具有催化2’，3’-cAMP和2’，3’-cGMP降解的功能。在本团队的专利申请书(申请号)中，使用腺相关病毒重组载体在腹主动脉结扎的大鼠心脏中过表达CNPase，该方法对心肌肥大疾病具有良好的治疗作用。目前CNPase突变型小鼠已有报道，但目前CNPase突变型斑马鱼相关的动物模型尚无报道，而且与斑马鱼心脏功能的研究尚未见报道。

本发明提供例如CNPase突变型斑马鱼的制备方法，可为CNPase在心脏中的功能研究提供动物模型。斑马鱼个体小，繁殖代际时间短，养殖成本低且易于管理；斑马鱼卵透明，便于观察和记录以及操作，其中myl7:GFP品系的斑马鱼是心肌特异性标记绿色荧光的斑马鱼品系，本发明采用该品系用于制备 CNPase突变型斑马鱼。

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)-Cas9是古细菌防御噬菌体入侵的一套分子免疫系统，具有识别外源性和切割外源性 DNA的功能。其中CRISPR是在细菌中发现的有规律成簇又带间隔的短回文序列，Cas9是。CRISPR-Cas9被用于基因组的精确编辑，具有高效，方便，快捷的优点，在本发明中，CRISPR-Cas9结合显微注射技术用于在斑马鱼CNPase基因的敲除。

本发明涉及到了CNPase突变型动物模型的建立以及在心血管领域的研究以及应用。

发明内容

本发明深入研究了CNPase与严重心衰伴随的心律过缓类疾病的联系，证实了CNPase是心功能维持所必不可少的，是潜在抗心衰的靶点。为了验证该猜想，发明人选用myl7：GFP斑马鱼胚胎作为验证心脏功能的模型。myl7：GFP斑马鱼为心肌特异性表达GFP蛋白的品系，而斑马鱼胚胎具有通体透明的特点，方便在胎胚时期读心功能以及血流动力学相关指标进行检测。采用吗啉环寡聚核苷酸(morpholino)和CRISPR/Cas9介导的cnpase基因编辑系统，通过显微注射的方式，对CNPase进行敲除和敲降。心脏形态以及动力学方面的评价结果显示， CNPase敲除或敲降可诱导斑马鱼自发性的严重心衰伴随的心律过缓乃至心衰，这证明CNPase是心脏功能维持所必不可少的，为CNPase作为治疗心肌病靶点提供了理论基础。

本发明描述了一种制备CNPase突变型斑马鱼的方法，并描述了CNPase敲除后对斑马鱼心脏功能的影响，其特征在于，制备方法如下：

(1)针对CNPase的第一个外显子序列，设计特异性的一对sgRNA序列，sgRNA1 其序列特征为sgRNA2其序列特征为其中斜体序列为T7启动子序列，红色部分为sgRNA核心序列；通用引物的序列为5′ -AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTA TTTCTAGCTCTAAAAC-3′。

(2)采用fill-in PCR方法和纯化的方法制备sgRNA DNA模板，结合体外转录以及乙醇沉淀的方法，获取sgRNA。

(3)通过显微注射的方法，在斑马鱼胚胎单细胞期，注射1nL sgRNA与Cas9 蛋白混合物；培育F1代。