[发明专利]一种有活性的落叶松增强子、获取及鉴定方法

权利要求书

1.一种有活性的落叶松增强子，DNA序列如SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的有活性的落叶松增强子的获取方法，其特征在于：包括如下步骤：用特异引物以日本落叶松的基因组DNA为模板，扩增得到560bp的扩增产物，即得所述的有活性的落叶松增强子。

3.根据权利要求2所述的有活性的落叶松增强子的获取方法，其特征在于：所述特异引物序列如下：

正向：5’-ggaatatgattaaagataaggaggtgttgatatttccagg-3’；

反向：5’-ctgtcaaacactgatagtttaaccctaacttcctcaatga-3’。

4.权利要求1所述的有活性的落叶松增强子的获取方法，其特征在于：落叶松RNA-seq：将落叶松针叶和诱导培养的落叶松愈伤组织分别进行转录组测序，利用无参考基因组方法拼装转录本，之后结合蛋白质数据库，对表达转录本进行注释；ATAC-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行ATAC-seq测序，获得基因组开放染色质序列，组蛋白ChIP-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行H3K27ac ChIP-seq测序，获得H3K27ac在基因组中的富集区域序列，整合测序数据，通过拼装获得落叶松序列SEQ ID NO.2，该序列中包括一个转录本，增强子位于开放染色质区域，与H3K27ac富集相关，可激活远端基因的表达，将其转录本远端具有开放染色质和H3K27ac的序列并扩增，最终获得SEQ ID NO.1。

5.权利要求1所述的有活性的落叶松增强子的鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将增强子DNA序列SEQ ID NO.1插入mini35s启动GFP载体中，构建LkENH1增强子载体；

(2)正对照载体采用CaMV35S-GFP，mini35s启动GFP载体为负对照；

(3)落叶松原生质体的制备与转化；

(4)转化后对增强子活性进行荧光验证。

6.根据权利要求5所述的有活性的落叶松增强子的鉴定方法，其特征在于：所述载体的构建方法：使用限制性内切酶SacI将mini35s启动GFP载体线性化，后用无缝连接试剂盒将其与增强子序列片段连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，得到LkENH1增强子载体。