[发明专利]一种催化活性提高的纤维小体及其组装方法和应用

权利要求书

1.一种催化活性提高的纤维小体，其特征在于，在细胞表面利用纤维小体的脚手架蛋白结构结合高活性的木质纤维素降解酶：所述的细胞为酿酒酵母，所述的脚手架蛋白包括来自黄色瘤胃球菌的两种粘连蛋白Coh1、Coh2，所述的木质纤维素降解酶为含对接模块的木聚糖酶AExynM-Doc1以及含对接模块的葡聚糖酶EG1-Doc2。

2.根据权利要求1所述的催化活性提高的纤维小体的组装方法，其特征在于，包括：

通过重叠PCR获得融合基因AExynM-Doc1，并将其插入pET-32a(+)载体，获得重组质粒pET-32a(+)-AExynM-Doc1；

通过重叠PCR获得融合基因EG1-Doc2，并将其插入pET-32a(+)载体，获得重组质粒pET-32a(+)-EG1-Doc2；

将所述重组质粒pET-32a(+)-AExynM-Doc1、pET-32a(+)-EG1-Doc2分别转入E.coliBL21中，IPTG诱导表达，获得含对接模块的木聚糖酶AExynM-Doc1和葡聚糖酶EG1-Doc2；

将人工合成的融合基因Coh1-Coh2插入pYD1载体，获得重组质粒pYD1-Coh1-Coh2；

将所述重组质粒pYD1-Coh1-Coh2转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae EBY100中，获得重组酵母EBY100/Coh1-Coh2；

将获得的木聚糖酶AExynM-Doc1、葡聚糖酶EG1-Doc2等量添加至获得的重组酵母EBY100/Coh1-Coh2菌体悬浊液中，使AExynM-Doc1、EG1-Doc2分别与Coh1、Coh2结合，完成纤维小体的体外组装。

3.根据权利要求2所述的催化活性提高的纤维小体的组装方法，其特征在于，所述融合基因AExynM-Doc1包括来自宇佐美曲霉的改造木聚糖酶基因AExynM和来自黄色瘤胃球菌的对接蛋白基因Doc1，所述AExynM-Doc1的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.8所示。

4.根据权利要求2所述的催化活性提高的纤维小体的组装方法，其特征在于，所述融合基因EG1-Doc2包括来自草菇的葡聚糖酶基因EG1和来自黄色瘤胃球菌的对接蛋白基因Doc2，所述EG1-Doc2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9所示。

5.根据权利要求2所述的催化活性提高的纤维小体的组装方法，其特征在于，所述融合基因Coh1-Coh2包括来自黄色瘤胃球菌的粘连蛋白基因Coh1、粘连蛋白基因Coh2以及连接肽编码基因，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，所述Coh1-Coh2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.10所示。

6.根据权利要求3所述的催化活性提高的纤维小体的组装方法，其特征在于，通过重叠PCR获得融合基因AExynM-Doc1的具体方法为：以pET-32a(+)-AExynM为模板，以Xyn-F和Xyn-R为引物进行第一轮PCR；以pUCm-T-Doc1为模板，以Doc1F和Doc1R为引物进行第二轮PCR；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，纯化后混合、在无引物的情况进行第三轮PCR；以第三轮PCR反应液为模板，以Xyn-F和Doc1R为引物进行第四轮PCR；将第四轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pET-32a(+)连接，获得重组质粒pET-32a(+)-AExynM-Doc1，所述引物序列为：

Xyn-F：AACGCTCAAACTTGTCTTAC，

Xyn-R：CTGAACAGTGATGGACGAA，

Doc1F：GTTTATGGTGATCTGGATGGT，

Doc1R：TTCAACCGGCAGGGTTTTAC。