[发明专利]一种尿液细胞培养方法

权利要求书

1.一种尿液细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将所有待使用实验用具在超净台紫外灯下灭菌30min，备用；向四孔板的每个孔中均加入配制好的0.1％明胶0.5ml，放入37℃培养箱中孵育30-60min；

S2：配制HUC1培养基，所需试剂及其体积如下：DMEM:F1244.15ml，FBS5ml，P/S 0.5ml，REGM Bullet Kit 50ul；配制HUC2培养基50ml，所需试剂及其体积如下：REBM 22.15ml，DMEM:F1222ml，FBS 5ml，P/S 0.5ml，REGM Bullet Kit 50ul；备用；

S3：尿液取样

取捐赠者尿液样本100ml，要求捐赠者饮用足够的水，并连续一周采集单个样本，避免第一次排尿；样品在容器中收集并保存在水浴中，尿液的前1/3舍弃，取后2/3的尿液于无菌培养瓶中，取完尿液后立即用50ml离心管分装；细胞分离与清洗：将分装多管后的尿液在离心机中以1500rpm离心10min，离心后取出，在超净台中轻缓倒出上清，每管剩余0.5ml尿液，向剩余的0.5ml尿液中加入之前配置好的细胞洗涤液1-2ml，细胞洗涤液含1％双抗的PBS，吹打混匀后将多管尿液合并于15ml离心管中，再次以1500rpm离心10min，倒去上清后获得细胞沉淀，将洗过的细胞重新聚集起来；

S4：尿液细胞接种

取步骤S1中的四孔板，吸出四孔板中的明胶，取500ul HUC1浸润四孔板；将第二次离心好的尿液倒出，留管底200-400μl含细胞的溶液，随后每管加入HUC1培养基1-2ml，每一个孔可接种500ul含细胞的培养基，加入HUC1后反复吹打混匀后接种至四孔板，接种细胞之后，在四孔板上做好标记，并放入5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；

S5：细胞培养和换液

原代细胞接种培养24h后即第二天时在显微镜下观察细胞，可见漂浮的尿液中残留的细胞，轻柔地更换培养基以去除漂浮细胞，此时使用HUC1进行全量换液，第三天时将原代培养基更换为扩大培养基，使用HUC2培养基进行全量换液，第四天不换液，第五天HUC2全量换液，第六天不换液，第七天HUC2半量换液，之后每隔一天后HUC2半量换液，直到细胞密度达70％以后传代。

2.根据权利要求1所述的一种尿液细胞培养方法，其特征在于，步骤S2中的HUC1培养基中含有1％青-链霉素和10％胎牛血清，还含有hEGF，Hydrocortisone，Epinephrine，Insulin，triiodothyronine，Transferrin，GA-1000；步骤S2中的HUC2培养基中含有1％青-链霉素和10％胎牛血清，还含hEGF，Hydrocortisone，Epinephrine，Insulin，triiodothyronine，Transferrin，GA-1000。