[发明专利]基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法

说明书

本发明涉及基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法。本发明筛选优化得到最佳的gRNA序列后将miR‑221敲除获得了转基因的脂肪干细胞后，针对RUNX2筛选获得了特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够抑制RUNX2的活性，将所述单抗加入到诱导培养基后，能够特异性的促进脂肪干细胞分化为软骨细胞，具有较好的诱导效率和应用价值。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法。

背景技术

关节软骨病变特别是膝关节病变的治疗一直是最具挑战性的临床难题之一。关节软骨属于透明软骨，有缓冲机械应力和保证关节的灵活运动等重要功能。但成年人的关节软骨组织缺乏血管、神经，无淋巴回流，并且组织细胞类型单一、高度分化，软骨细胞包埋于大量致密基质中，限制了其增殖、迁移能力。因此，组织的自愈能力有限，即使较小的软骨损伤也可能导致骨关节炎，并发展为进行性炎症从而导致关节退化和运动能力丧失。目前，手术治疗关节软骨损伤的方法主要包括软骨下钻孔、微骨折、磨削成形术、关节置换术和自体软骨细胞移植等，但这些方法因受技术难度、组织整合差和发育形成纤维软骨的影响存在局限性，而软骨组织工程为解决这些难题提供了新的思路。

软骨组织工程的主要目标是通过种子细胞、具有诱导分化能力的生物活性分子以及能为细胞生长创造适当环境的生物材料(如支架)的有效组合产生与天然软骨生物学功能相近的新透明软骨，实现组织结构和功能的再生。种子细胞可来源于软骨细胞、胚胎干细胞或组织干细胞，是修复或替换受损组织的关键，其中成体多功能干细胞的应用不涉及伦理问题，来源相对充足且增殖修复能力较强，成为较理想的研究对象。脂肪干细胞ADSCs是软骨组织工程中研究最为深入的MSCs类型， ADSCs的主要优点在于组织来源丰富且易获取，ADSCs在特异性诱导因子的作用下可分化为软骨细胞。

体外诱导ADSCs成软骨分化所需的分化培养基通常为含有一系列生长因子的混合物。其中，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是ADSCs成软骨分化培养基中最重要的组分，其在哺乳动物体内有3种亚型：TGF-β1，-β2和-β3。TGF-β通过与ADSCs表面受体结合，使I型受体即激活素受体激酶-5(activin receptor-like kinase-5，ALK-5)磷酸化，进而激活Smad通路，启动软骨特异性基因的转录。TGF-β1具有双相作用：在100pg/mL-1 ng/mL的浓度范围内增强内皮细胞的增殖和侵袭效应，在5-10 ng/mL范围内抑制内皮细胞侵袭和毛细血管形成，诱导ADSCs的成软骨分化。TGF-β的3种亚型对ADSCs都有一定的成软骨诱导效应，但3种亚型诱导效应的不同之处暂无定论，目前研究表明对ADSCs而言TGF-β1与TGF-β3的诱导效应并无显著差异。

因应用外源性生长因子效率低、半衰期短，有学者提出了一种长期稳定的诱导方式，即利用基因转染上述生长因子的目的基因得到内源性生长因子，通过分泌途径发挥作用。尽管基因操作可控制特定生长因子的分泌，但由于软骨形成是由多种生长因子和其他信号分子协调操控的，所以一次只能靶向一种基因限制了基因转染的应用潜力，但是目前研究还不够多，还有很大的改进空间。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供一种改进的诱导干细胞成为软骨细胞的方法。

具体的，发明人发现在脂肪干细胞中，通过将miR-221敲除以及抑制RUNX2的活性，能够特异性的促进脂肪干细胞分化为软骨细胞。

一方面，本发明提供一种基因编辑修饰的脂肪干细胞。

所述修饰为将脂肪干细胞的miR-221进行敲除。

具体的，根据miR221的前体序列，设计了多组gRNA序列，其中筛选获得最优的g4-RNA作为实验序列。具体的gRNA序列如SEQ ID NO：1所示, gRNA4:TGTAGATTTCTGTGTTCGTTAGG。