[发明专利]一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT‑PCR引物探针组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。本发明所述引物探针组包括检测禽流感病毒H5亚型、检测禽流感病毒H7亚型和检测禽流感病毒H9亚型的引物探针及内参引物探针。本发明引物探针组加入MS2内参质控核酸提取和扩增的过程，可有效避免假阴性结果，可用于禽类血液、组织、咽喉拭子、泄殖腔拭子等样品中的禽流感病毒H5、H7和H9亚型核酸检测，为禽流感病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒引起的禽类(家禽或野禽)及部分哺乳动物的动物传染病。

禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异快，宿主范围广，各亚型间交叉保护性差，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的毁灭性疫病的病原之一。尤其是高致病性禽流感病毒(HPAIV)，是OIE规定的法定报告A类动物疫病病原。其中H5NX亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。H9亚型禽流感并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型的禽流感病毒。

目前国内外检测禽流感病毒最经典、最常用的方法是使用鸡胚进行病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。以分子生物学技术为基础的荧光PCR方法已成为病原核酸检测的主要方法，其灵敏度和精确度不断提高，但是仍存在操作误差、核酸提取效率未知等因素，影响检测结果的可靠性和可比性，不利于检测方法标准化。因此，目前仍缺乏一种高效可靠的标准化禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒。本发明所述引物探针组具有特异性强、敏感性高、准确性高、省时省力等优点，可为禽流感病毒不同亚型的诊断提供了一种快速检测方法，为禽流感病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

本发明提供了一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组，所述引物探针组包括检测禽流感病毒H5亚型的BD-H5-F、BD-H5-R和BD-H5-LP；检测禽流感病毒H7亚型的O-H7-F1、O-H7-R1和O-H7-LP1；检测禽流感病毒H9亚型的O-H9-F、O-H9-R和O-H9-P；和内参MS2-F、MS2-R和MS2-P；所述BD-H5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述BD-H5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述BD-H5-LP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述O-H7-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述O-H7-R1的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述O-H7-LP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述O-H9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述O-H9-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述O-H9-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述MS2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述MS2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述MS2-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述BD-H5-LP、O-H7-LP1、O-H9-P和MS2-P的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端均标记MGB。

优选的是，所述荧光基团包括FAM、VIC、ROX和Cy-5。

优选的是，待检测的样品包括禽类的血液、组织、咽喉拭子和泄殖腔拭子。