[发明专利]一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法

说明书

本发明涉及一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法。其特征是在pH为2～6的条件下，采用亲水色谱柱对其进行分离。本方法是根据氨基葡萄糖数目的多少进行壳寡糖的分离，因此能够分离不同乙酰化程度的壳寡糖，同时对高聚合度的样品仍具备分离能力，这对单一乙酰化程度壳寡糖的色谱定性定量分析、分离纯化及其生物活性研究具有十分重要的意义。

技术领域

本发明属于生物化学分析检测领域，涉及一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法。

技术背景

壳寡糖(AnDm)是由N-乙酰氨基葡萄糖(A)和/或氨基葡萄糖(D)通过β-1,4糖苷键连接而成的线性寡糖。作为甲壳素和壳聚糖的降解产物，壳寡糖的聚合度一般在2～20左右。壳寡糖因分子量低，水溶性好，吸收率高，而表现出多种多样的生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、降血压、稳定DNA、促进伤口愈合、促进骨组织形成和增强骨骼强度等。

壳寡糖的生物活性与其聚合度、乙酰化程度和乙酰化位点密切相关。然而其生物活性的报道多是基于壳寡糖的混合物，因而难以阐明其生物活性与物质基础的关系。此外，由于壳寡糖样品制备的不重复性，壳寡糖混合物的聚合度和乙酰化程度存在着差异，这还会使得其生物活性的研究报道产生争议。

因此，为深刻理解壳寡糖的活性机制，需要使用充分表征的、高纯度的单一壳寡糖进行活性研究。目前，单一聚合度壳寡糖的分离已有报道。然而，单一乙酰化程度壳寡糖的分离仅限于低聚合度的简单壳寡糖，如DP＝3的A1D2和A2D1，DP＝4的A1D3,A2D2和A3D1以及DP＝6的各不同乙酰化程度的壳寡糖，但尚未见高聚合度的单一乙酰化程度壳寡糖分离的相关研究。本发明则提供了一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法，尤其研究了高聚合度壳寡糖的分离，以期为单一乙酰化程度壳寡糖的色谱定性定量分析、分离纯化及其生物活性研究提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法。

为实现上述目标，本发明采用的技术方案为：在pH为2～6的条件下，采用亲水色谱柱对不同乙酰化程度的壳寡糖进行分离。

所述壳寡糖具有相同的聚合度不同的乙酰化程度。壳寡糖(AnDm)的结构式如下：

其中，聚合度DP＝n+m，在2～30之间；乙酰化程度DA＝n/DP×100％，同一DP的壳寡糖，A或D的数目可以直接用于量化DA。

所述pH为3～5，通过在流动相中添加酸性添加剂中的一种或二种以上进行调节。

所述流动相为有机相和水相，或有机相水溶液；有机相为乙腈、乙醇、甲醇等中的一种或多种组合。

所述酸性添加剂的添加方式为在有机相和水相，或有机相水溶液中分别添加或在任意一相中添加。

所述酸性添加剂的种类、浓度及其pH为如下二类中的一种或二种以上：

第一类，甲酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸中的一种或二种以上，体积分数均为0.01～10％；

第二类，甲酸铵缓冲盐、甲酸三乙胺缓冲盐、乙酸铵缓冲盐、乙酸三乙胺缓冲盐、磷酸铵缓冲盐、磷酸三乙胺缓冲盐、磷酸钾缓冲盐或磷酸钠缓冲盐中的一种或二种以上，浓度均为1～200mM，pH均为2～6。

所述亲水色谱柱为硅胶色谱柱或键合有极性基团的硅胶色谱柱中的一种或二种以上；极性键合基团为酰胺、氨基酸、氨基、氰基、二醇、羧基、糖基和两性离子等中的一种或多种组合；

所述亲水色谱柱柱内径为2.1～200mm；亲水色谱柱柱长为50～250mm；填料粒径为1.7～30μm；填料孔径为填料比表面积为180～350m²/g。

所述硅胶基质色谱柱上极性基团的键合量为0.1～20μmol/m²。